呂沁風(fēng) 羅鵬 何蕾 楊永耀 鄭偉 李莉 吳忠華

（浙江國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，杭州　310003）

甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP檢測(cè)方法的建立

呂沁風(fēng) 羅鵬 何蕾 楊永耀 鄭偉 李莉 吳忠華

（浙江國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，杭州310003）

建立一種新型等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，用于提高等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的檢測(cè)速度，應(yīng)用于甲型H1N1流感病毒檢測(cè)。根據(jù)HA基因設(shè)計(jì)一組引物，包括外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物及套內(nèi)引物，套內(nèi)引物的加入增加了引物與模板的接觸位點(diǎn)，提高擴(kuò)增效率，縮短檢測(cè)時(shí)間。結(jié)果顯示，F(xiàn)AST-LAMP檢測(cè)法比普通LAMP檢測(cè)法時(shí)間縮短45 min左右，比加入環(huán)引物的LAMP檢測(cè)方法縮短20 min，大大縮短了反應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間。檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1×102拷貝。FAST-LAMP是一種高效、更快的檢測(cè)方法。

FAST-LAMP；甲型H1N1流感病毒；檢測(cè)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種引物，在等溫60-65℃條件下利用Bst聚合酶即可進(jìn)行109-1010倍的核酸擴(kuò)增［1，2］。LAMP產(chǎn)物通過濁度或者熒光變化可用肉眼觀察，具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［3，4］。自2000年環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)問世以來，該方法在病原體檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［5-8］。如何在現(xiàn)有的LAMP技術(shù)基礎(chǔ)上，發(fā)掘更高效快速的等溫?cái)U(kuò)增方法，成為重要的研究方向，目前最快速的LAMP反應(yīng)方法是加入環(huán)引物［9，10］。本研究設(shè)計(jì)一種新型快速的等溫?cái)U(kuò)增方法，改變其現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)方法，使環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)擴(kuò)增完成的時(shí)間比加入環(huán)引物所用的時(shí)間更短。

流行性感冒病毒，屬于正黏液病毒科，是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒，它會(huì)造成急性上呼吸道感染，并在空氣中迅速傳播，在世界各地常會(huì)有周期性的大流行［11，12］。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感病毒是變異最為頻繁的一個(gè)類型［13］。2009年起源于墨西哥的的甲型H1N1流感病毒爆發(fā)流行造成全球數(shù)千萬人大流行，死亡人數(shù)達(dá)到1 800多人［14，15］。在大流行后期，該病毒仍在流行，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證實(shí)該病毒在2013年仍為歐洲、亞洲等地流感的流行株［16-23］。2013年美國(guó)、中國(guó)內(nèi)地仍有死亡病例報(bào)道［24-27］。本試驗(yàn)以甲型H1N1流感為例研究新型快速等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，旨在為了建立新型等溫?cái)U(kuò)增方法，提高檢測(cè)速度提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購用QIAGEN公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，Bst-DNA polymerase購自NEB公司。TaKaRa Ex Taq酶和dNTP購自TaKaRa公司，RNase Inhibitor購自Fermentas公司，MgSO4和Betain為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，EVA Green購自Biotium公司、DNA Marker DL2000和瓊脂糖Agrose 購自TaKaRa公司。甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、副流感病毒、人偏肺病毒等為本室保存。

1.1.2 儀器 2720型PCR儀和7500型熒光定量PCR儀購置購自ABI公司，電泳儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 常規(guī)LAMP技術(shù)含有一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物，選擇加入一對(duì)環(huán)引物，可在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。本研究根據(jù)甲型H1N1流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）基因保守區(qū)設(shè)計(jì)一組引物族［20，27］，引物的設(shè)計(jì)是在帶有環(huán)引物的外FIP1和外BIP1的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)域再次設(shè)計(jì)內(nèi)FIP2和內(nèi)BIP2引物，使得FIP1和BIP1的產(chǎn)物能再次成為FIP2和BIP2的LAMP擴(kuò)增模板，F(xiàn)IP1和BIP2、FIP2和BIP1也同時(shí)形成正常的LAMP擴(kuò)增系統(tǒng)。即本套引物同時(shí)形成了4套獨(dú)立的LAMP擴(kuò)增系統(tǒng)，從而使擴(kuò)增速率增加。引物序列，見表1。

表1 甲型H1N1流感病毒核酸FAST-LAMP擴(kuò)增引物

1.2.2 病毒RNA的提取 嚴(yán)格按QIAGEN RNA抽提試劑盒說明書提取病毒RNA，溶于100 μL無RNase水中，-70℃保存。

1.2.3 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 FAST-LAMP反應(yīng)體系如下：10×buffer 2.5 μL，引物混合物1 μL（引物混合物中各引物濃度分別如下：F3、B3各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP各15 μmol/L，Loop-f、Loop-r各5 μmol/L， FNP、BNP各15 μmol/L），模板RNA 1 μL，8 U Bst-DNA聚合酶1 μL，10 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，甜菜堿（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20× 的 Eva green加入DEPC-H2O補(bǔ)足25 μL。普通RT-LAMP反應(yīng)體系除引物混合物為（引物混合物中各引物濃度分別如下：F3、B3各 1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP各 15 μmol/L），加入環(huán)引物的引物混合物為（F3、B3各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP各15 μmol/L，Loop-f、Loop-r各5 μmol/L），其他與FAST-LAMP一致，反應(yīng)條件為：63℃，55 s，熒光采集5 s，100個(gè)循環(huán)在熒光定量PCR儀（Chromo4-Bio-Rad公司）中進(jìn)行。引物混合物中各引物濃度，見表2。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn) 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機(jī)引物法將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收，對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)定OD值，根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度和OD值進(jìn)行copies數(shù)計(jì)算。將cDNA進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋，取1 μL作為模板加入反應(yīng)體系中，在63℃恒溫條件下，反應(yīng)60 min。在熒光定量PCR儀上觀察實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)圖，并取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 利用FAST-LAMP反應(yīng)體系，以H3N2、乙型流感、水痘病毒、人偏肺病毒、副流感病毒等核酸作為待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀察實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果選擇陰性、1×102copies/μL、1×104copies/μL和 1×106copies/μL濃度的cDNA模板分別進(jìn)行FAST-LAMP，每份樣本各取1 μL重復(fù)3次，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，觀察反應(yīng)的Ct值，根據(jù)Ct值計(jì)算變異系數(shù)，對(duì)該方法的重復(fù)性進(jìn)行考核。

表2 各反應(yīng)體系中的引物組成及引物濃度

1.2.7 擴(kuò)增方法反應(yīng)時(shí)間比較 將普通LAMP、加入環(huán)引物L(fēng)AMP和FAST-LAMP反應(yīng)采用同一樣本同時(shí)檢測(cè)，反應(yīng)條件為63℃，55 s，熒光采集5 s，100個(gè)循環(huán)。

1.2.8 產(chǎn)物測(cè)序分析 將FAST-LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行序列分析，分別采用內(nèi)引物和套內(nèi)引物為測(cè)序引物。

1.2.9 樣本檢測(cè) 收集浙江口岸機(jī)場(chǎng)發(fā)熱人員鼻咽拭子35份，根據(jù)說明書提取RNA，采用FASTLAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 不同擴(kuò)增方法反應(yīng)時(shí)間的比較

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的結(jié)果（圖1）可見，F(xiàn)ASTLAMP的反應(yīng)時(shí)間控制在40-45 min左右，加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間為65 min左右，普通LAMP反應(yīng)時(shí)間在90 min左右。

圖1 甲型H1N1流感病毒不同擴(kuò)增方式實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，電泳反應(yīng)結(jié)果（圖2）顯示，甲型H1N1流感病毒出現(xiàn)與普通LAMP反應(yīng)相似的階梯狀條帶，且條帶比普通LAMP反應(yīng)更多。此外，陰性對(duì)照、H3N2病毒、乙型流感病毒、水痘病毒、人偏肺病毒和副流感病毒核酸的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，由此顯示了該方法具有較好的特異性。

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

在熒光定量PCR儀上觀察實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)圖，結(jié)果見圖2；并取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3，1-5泳道均出現(xiàn)細(xì)密的階梯狀條帶，表示出現(xiàn)有陽性擴(kuò)增反應(yīng)?？梢耘卸ū痉椒ǖ臋z測(cè)極限約為1×102copies/μL。

圖3 甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP靈敏度實(shí)時(shí)熒光曲線

圖4 甲型H1N1流感病毒Fast-LAMP靈敏度電泳結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP的結(jié)果，記錄各次試驗(yàn)的Ct值。根據(jù)Ct值計(jì)算SD值及變異系數(shù)（CV%），見表3。結(jié)果表明強(qiáng)陽性及臨界值樣本的CV值均小于5%，重復(fù)性良好。

2.5 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

由于產(chǎn)物組成的復(fù)雜性，出現(xiàn)了個(gè)別堿基錯(cuò)配，各引物檢測(cè)FAST-LAMP產(chǎn)物序列分析的整體結(jié)果表明，套內(nèi)引物FNP和BNP、內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP組合均能擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物，環(huán)引物也能與FNP擴(kuò)展出相應(yīng)的產(chǎn)物。由此可證明本檢測(cè)方法中各引物之間確實(shí)能各自組合擴(kuò)增。

表3 甲型H1N1流感病毒FAST-LAMP重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣本檢測(cè)

采用FAST-LAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35例機(jī)場(chǎng)口岸送檢本實(shí)驗(yàn)室的鼻咽拭子樣本中有8例甲型H1N1流感病毒陽性，與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果相符。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單，無需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，反應(yīng)在1-1.5 h內(nèi)完成，靈敏度高，吸引了大量的研究力量投入到了該領(lǐng)域的研究。目前環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)僅僅是在該方法建立基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)方法檢測(cè)目的基因，或是在產(chǎn)物的檢測(cè)方式上有所改變，在擴(kuò)增方式上沒有實(shí)質(zhì)性的創(chuàng)新［1-7］。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀中觀察LAMP的擴(kuò)增曲線從Ct值到平臺(tái)期的時(shí)間非常短，一般均在2 min之內(nèi)［28］，即潛伏期的長(zhǎng)短決定了整個(gè)反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短。LAMP反應(yīng)是以產(chǎn)物的量為判斷依據(jù)，在普通LAMP中和模板接觸的是一對(duì)引物，4個(gè)位點(diǎn)決定了LAMP反應(yīng)的內(nèi)在擴(kuò)增效率，除此之外，引物濃度等的條件優(yōu)化、模板量和酶的量等決定了外在的擴(kuò)增效率，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于提高反應(yīng)的內(nèi)在擴(kuò)增效率。在LAMP反應(yīng)體系中加入環(huán)引物增加了兩個(gè)與核酸模板接觸的位點(diǎn)［9］，提高了擴(kuò)增效率，但不改變產(chǎn)物的種類。如果把引物和模板的結(jié)合位置由4個(gè)變?yōu)?個(gè)，那么反應(yīng)的產(chǎn)物將由1種變?yōu)?種，理論上能大幅增加擴(kuò)增效率。

本研究的設(shè)計(jì)方案：在目的基因內(nèi)兩端設(shè)計(jì)常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物（一對(duì)外引物F3、B3和一對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP），并留出設(shè)計(jì)套內(nèi)引物FNP、BNP和環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r的足夠堿基；加入環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，可使LAMP反應(yīng)中引物和核酸模板接觸的位置增加兩個(gè)，提高了擴(kuò)增效率。在外側(cè)內(nèi)引物FIP和BIP之間設(shè)計(jì)一對(duì)套內(nèi)引物FNP、BNP，此時(shí)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不但能用套內(nèi)引物FNP與BNP根據(jù)核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)也可以和外側(cè)常規(guī)LAMP引物擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合并擴(kuò)增，使與核酸模板接觸的位置又增加了4個(gè)。套內(nèi)引物FNP 不但可以和套內(nèi)引物的BNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能與外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物BIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增，增大了與核酸模板結(jié)合和擴(kuò)增的機(jī)會(huì)；反之，套內(nèi)引物BNP也可以與套內(nèi)引物的FNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能與外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物FIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。常規(guī)LAMP反應(yīng)和加入環(huán)引物的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物只有1種產(chǎn)物的循環(huán)序列，加入環(huán)引物不改變產(chǎn)物的序列；在加入套內(nèi)引物后，產(chǎn)物就是4種擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)序列，即內(nèi)引物FIP、BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP、BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物。

在本次試驗(yàn)中FAST-LAMP的反應(yīng)時(shí)間比普通LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短了45 min左右，比加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短了15 min左右，在相同條件的情況下大大提高了反應(yīng)的擴(kuò)增效率。本方法擴(kuò)增出的LAMP產(chǎn)物為4種不同LAMP組合的混合物的倍數(shù)條帶，陽性條帶大小的差異很小，條帶分布比普通LAMP更加細(xì)密，故而梯度狀條帶不是很清晰。本方法的產(chǎn)物經(jīng)電泳割膠回收后測(cè)序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，各引物之間能相互擴(kuò)增。相比用傳統(tǒng)的LAMP檢測(cè)技術(shù)，該方法在檢測(cè)時(shí)間上大大縮短，普通LAMP用于檢測(cè)H1N1病毒仍需在1.5 h左右，且靈敏度與本研究建立的檢測(cè)方法相當(dāng)［29，30］。由于受病毒基因的限制，該檢測(cè)方法的改進(jìn)在細(xì)菌檢測(cè)、物種鑒定等檢測(cè)中具有更大的發(fā)展前景，可將反應(yīng)時(shí)間控制更短。

4 結(jié)論

在相同的檢測(cè)條件下，本研究建立的改良的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法應(yīng)用于甲型H1N1流感病毒檢測(cè)，具有更快的擴(kuò)增速度。檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1×102拷貝，特異性與重復(fù)性良好；具有簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Establishment of FAST-LAMP Method for Detecting Influenza A（H1N1）Virus

Lü Qinfeng Luo Peng He Lei Yang Yongyao Zheng Wei Li Li Wu Zhonghua
（Zhejiang International Travel Healthcare Center，Hangzhou310003）

It was to establish a new loop-mediated isothermal amplification（FAST-LAMP）for rapidly detecting influenza A（H1N1）virus. A set of primers were designed according to HA gene， including the outer primers， internal primers， loop primers and nest internal primers. The nest internal primers increased the contact sites of primers and nucleic acid template， so that the amplification efficiency could be improved and detection time reduced. The FAST-LAMP method could be 45 less than LAMP method， and 20 minutes less than LAMP method with loop primers， i.e. detection time reduced significantly detecting sensitivity reached 1×102copies cDNA template/tube. It proved that the established FAST-LAMP method is an efficient and reliable method for detecting influenza A（H1N1）virus.

FAST-LAMP；H1N1 influenza virus；detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.013

2014-08-14

國(guó)家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201010043），國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2013IK245）

呂沁風(fēng)，女，碩士，副主任技師，研究方向：傳染病檢測(cè)；E-mail：fionallll@163.com