向小華焦禹順吳新儒程亞增侯爍，3劉貫山王元英

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所　中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島　266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京， 100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，青島　266109）

一種從非變性聚丙烯凝膠中回收小片段DNA的方法

向小華1，2焦禹順1，2吳新儒1程亞增1，2侯爍1，3劉貫山1王元英1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京， 100081；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，青島266109）

利用高分辨率的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、純化特異性小片段DNA的首選方法，也是開展后續(xù)多種分子生物學(xué)試驗(yàn)的前提。本試驗(yàn)比較了改良煮沸法（液氮研磨+煮沸+低溫濃縮）、煮沸法及直取法回收小片段DNA，以回收樣品模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：改良方法回收的DNA 的純度高，特異性好，回收率與經(jīng)典煮沸法相當(dāng)。在保證回收產(chǎn)物的特異性時(shí)，用低溫濃縮法替代乙醇/醋酸鈉共沉淀也具有可行性及一定的創(chuàng)新性。

非變性聚丙烯凝膠；DNA小片段；二次PCR；改良煮沸法；膠回收

在生命科學(xué)飛速發(fā)展的今天，對(duì)于生命的探索已深入到分子水平。在分子生物學(xué)試驗(yàn)中，對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的目的DNA 片段進(jìn)行回收和純化，除去非特異性的DNA 片段，進(jìn)行后續(xù)研究是一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。鑒于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率相對(duì)較低，尤其是回收片段大小在50 bp的DNA片段 時(shí)存在較大的局限性［1，2］，借助于分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）回收純化小片段DNA，具有操作簡(jiǎn)單、回收純度高、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、同時(shí)可操作回收多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于小片段DNA 的回收純化［3，4］。目前有幾種常用的回收方法［5-7］，在市場(chǎng)上也有知名生物試劑公司開發(fā)了相應(yīng)的回收純化試劑盒，但這些回收方法都表現(xiàn)出經(jīng)濟(jì)成本與高效性不可兼得的矛盾。因此，探索一種操作相對(duì)簡(jiǎn)單、回收效率較高、回收成本較低的實(shí)用方法尤為重要。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上［8-10］，通過液氮研磨增加PAGE凝膠的破碎度，利用煮沸法從非變性聚丙烯酰胺凝膠中最大程度地釋放、回收純化目的DNA 片段并結(jié)合低溫濃縮的方法，并將回收后的DNA 用于第二次PCR的模板，再與常規(guī)直取法的結(jié)果進(jìn)行比較，旨在驗(yàn)證這種純化方法的實(shí)用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為中煙100經(jīng)過EMS誘變處理得到的白莖突變體（Mutant，M）［11］和野生型中煙100（Wild type，WT）的種子各30粒，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所劉貫山研究員提供。種子經(jīng)常規(guī)消毒培養(yǎng)4周后進(jìn)行假植，待材料生長(zhǎng)到5-6片真葉時(shí)，取材料的新鮮葉片提取基因組DNA，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 試劑 30%丙烯酰胺儲(chǔ)液（丙烯酰胺∶N，N'-亞甲叉雙丙烯酰胺=29∶1）；雙蒸水；10%過硫酸銨（APS）；10×TBE；1×TBE Buffer；TEMED；20 bp DNA Ladder Marker（TaKaRa）；親和硅烷，剝離硅烷，植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen），特異性SSR引物PT51778，Thermor PCR mix（內(nèi)含：Taq酶、dNTPs、Mg2+，Reaction Buffer、Loading Buffer）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照試劑盒提供的步驟提取材料的基因組DNA，具體操作步驟如下：（1）取煙草新鮮葉片組織0.1 g，加入液氮充分研磨，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。（2）將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μL 65℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中（試驗(yàn)時(shí)現(xiàn)加β-巰基乙醇，使終濃度達(dá)0.1%），迅速顛倒混勻后，65℃溫育20 min，期間顛倒混勻3-4次。（3）加入700 μL氯仿，充分混勻，12 000 r/min離心5 min。（4）取上清液轉(zhuǎn)入一新的離心管中，加入700 μL緩沖液GD2，充分混勻。（5）將混勻的液體轉(zhuǎn)到吸附柱CB3中，12 000 r/min離心30 s，棄掉廢液。（6）向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。（7）向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。（8）重復(fù)步驟（7）。（9）將吸附柱放入收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱中的漂洗液。（10）將吸附柱置于另一干凈的離心管中，加入100 μL TE，室溫放置2-5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中，并進(jìn)行定性定量檢測(cè)。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增目的片段 使用Bio-Rad PCR儀C1000進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增。10 μL反應(yīng)體系包括：2×Thermor supermix 5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，模板DNA 2 μL，50 ng，加ddH2O至反應(yīng)體積為10 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃后延伸10 min，產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 目的片段的非變性PAGE檢測(cè) 6%非變性PAGE膠的制備參照《分子克隆技術(shù)指南（第3版）》［12］，待凝膠完全凝聚后，于電泳槽中加入足量的1×TBE 緩沖液60 W預(yù)電泳15 min，取4 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行60 W恒功率電泳檢測(cè)，電泳至指示劑二甲苯青接近膠板2/3 處停電泳。

1.2.4 凝膠的硝酸銀染色顯示 電泳結(jié)束后，凝聚染色按照朱丹等［13］報(bào)道的方法加以改進(jìn)。具體步驟如下：（1）水洗：將凝膠板放入含1 L去離子水的染色盤中，再漂洗30 s。（2）銀染：在盤中加入1 L蒸餾水，1.5 g AgNO3和1 mL甲醛，120 r/min振蕩10-15 min。（3）水洗：取出染色板，在1 L蒸餾水中快速蕩洗十幾秒。（4）顯影：在1 L冷的顯影液（1000 mL蒸餾水+16 g NaOH+4-5 mL甲醛）中振蕩，然后將盆放在搖床上輕輕搖動(dòng)至條帶清晰顯現(xiàn)，直至條帶出現(xiàn)，終止顯影并用去離子水潤(rùn)洗膠面3-4次。

1.2.5 PAGE膠中差異條帶的回收

1.2.5.1 直取法 參照陳亮等［14］方法進(jìn)行。在膠濕潤(rùn)時(shí)直接使用無菌的10 μL槍頭在聚丙烯酰胺凝膠的目標(biāo)條帶的同一位置上輕扎1-3次，在PCR反應(yīng)液中反復(fù)吸打，以槍頭上沾有的小膠塊作為PCR反應(yīng)的DNA模板，重復(fù)2-3個(gè)PCR反應(yīng)以避免模板未轉(zhuǎn)移到管中的情況。

1.2.5.2 煮沸法 參照文獻(xiàn)［15，16］進(jìn)行。切下目的條帶，取等量的凝膠分別放入兩個(gè)無菌離心管中，向保留有凝膠的離心管中用100 μL雙蒸水清洗兩遍后吸干殘留液，用無菌槍頭尖將凝膠碾碎，在含有凝膠的離心管中加入100 μL雙蒸水，100℃煮沸15 min，12 000 r/min離心5 min后，將上清液（DNA粗回收液）移至一新的離心管中。參照文獻(xiàn)［15］的方法步驟進(jìn)行純化回收，在上清液加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積3 mol/L的醋酸鈉（pH5.2），-20℃放置1 h；4℃，12 000 r/min離心20 min，吸棄上清；用75%乙醇洗滌沉淀2 次；4℃，12 000 r/min離心2 min，吸棄上清；待乙醇揮發(fā)干凈后，用雙蒸水溶解沉淀，取5 μL用作PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5.3 改良的煮沸法 切下目的條帶，取等量的凝膠分別放入兩個(gè)無菌離心管中，向保留有凝膠的離心管中用100 μL 雙蒸水清洗兩遍后吸干殘留液。在吸干水分的凝膠中2 mL離心管中加入兩顆干凈的鋼珠，置于液氮中5 min左右，在植物組織破碎儀上研磨（頻率為1 000 Hz/min），使凝膠呈粉末狀，后在管中加入100 μL雙蒸水，98℃煮沸15 min。后在室溫放置30 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液于新離心管中，將離心管放置在濃縮儀中低溫（4℃）濃縮至液體體積為30 μL時(shí)，測(cè)定濃度，并取5 μL做為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 煙草基因組DNA的提取

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，提取的煙草基因組DNA條帶單一，無彌散現(xiàn)象，且一致性較好（圖1）。紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果表明，所提取的DNA的OD260/OD280基本在1.7-1.9之間，沒有超出2.0，說明提取的DNA中沒有蛋白質(zhì)、酚污染；且OD260/OD230基本都在1.9-2.1之間，表明DNA純度較高，沒有小分子污染。綜上分析，提取的煙草基因組DNA符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 1%瓊脂糖檢測(cè)基因組DNA

2.2 目的DNA的獲取

SSR引物PT51778在煙草野生型和突變體中的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1% 的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)的結(jié)果（圖2-A）顯示，目的DNA 片段（大小在100-200 bp之間）得到了有效擴(kuò)增。利用1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，除了目的條帶以外沒有展示出非特異性擴(kuò)增的條帶。但利用6%非變性聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)，除目的條帶外，還有一些大小不等的非目的條帶（圖2-B），這也驗(yàn)證了非變性聚丙烯凝膠的分辨率高于普通瓊脂糖凝膠。

圖2 1%瓊脂糖（A）和6%非變性聚丙烯凝膠（B）電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 不同回收DNA方法的比較

將目的條帶從非變性凝膠上切下按照不同方法回收，取回收產(chǎn)物為模板經(jīng)PCR二次擴(kuò)增。結(jié)果顯示，3種方法回收的目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物均獲得了預(yù)期大?。?50 bp 左右）的目的片段，這進(jìn)一步驗(yàn)證了試驗(yàn)選用的方法對(duì)于回收DNA小片段具有的可行性。但比較不同方法之間的回收產(chǎn)物用于第二次PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)量表明，直取法回收的DNA經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出有效目標(biāo)片段大小的產(chǎn)物量平均約為30 ng/μL。而改良煮沸法回收DNA為模板的PCR反應(yīng)擴(kuò)增出有效目標(biāo)片段大小的產(chǎn)物平均量與經(jīng)典煮沸法的量相當(dāng)，約是直取法的4倍，均在120 ng/μL左右（圖3）。產(chǎn)物經(jīng)與克隆載體連接、轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選等操作，陽性克隆的測(cè)序結(jié)果顯示插入片段單一。因此可用于后續(xù)的研究，這也驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)方法是可行的。

圖3 不同方法回收DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

3 討論

目標(biāo)DNA片段的回收和純化是進(jìn)行下游分子生物學(xué)的基礎(chǔ)步驟。近年來已有不少報(bào)道關(guān)于DNA回收與純化的方法，但大都局限用于瓊脂糖凝膠［17，18］而從非變性PAGE膠中回收和純化DNA的報(bào)道較少［19］。由于瓊脂糖凝膠的分辨率較低，所以具有高分辨率的聚丙烯凝膠電泳（PAGE）在回收小片段等多種基因工程操作中作用尤其重要。目前較常用是煮沸法和沉淀法，但由于聚丙烯酰胺凝膠具有在高溫下不熔，強(qiáng)韌致密的結(jié)構(gòu)，煮沸、擠壓、搗碎、浸泡的處理都不甚理想的特點(diǎn)，這些限制了DNA 的釋放，從而影響回收的效率［20］。目前報(bào)道的幾種方法，不是回收率低，就是操作繁瑣，價(jià)格昂貴［21］。因此，完善而高效的回收方案亟待探索。本試驗(yàn)在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上采用直取法、煮沸法和改良煮沸法回收DNA小片段，均得到了目的條帶，但改良方法獲得的目的條帶的濃度較直取法更大，效率高，這也驗(yàn)證了本試驗(yàn)借助液氮對(duì)聚丙烯酰胺凝膠的固化作用后研磨凝膠，破壞凝膠的結(jié)構(gòu)使得DNA最大限度的從凝膠中釋放出來，經(jīng)煮沸后不用乙醇沉淀，選用常溫濃縮減少目的產(chǎn)物的損失，從而提高了DNA 的回收率。試驗(yàn)結(jié)果也表明，本研究改良的方法是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、回收率高的方法能被廣大實(shí)驗(yàn)室研究人員所接受。

4 結(jié)論

經(jīng)過比較不同方法，本研究運(yùn)用液氮研磨使凝膠固化粉末，煮沸及常溫濃縮處理，使凝膠中小片段DNA最大限度的釋放，得到了高濃度，純度較好的目的的片段。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Method of Recovering Short DNA Fragments from Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Xiang Xiaohua1，2Jiao Yushun1，2Wu Xinru1Cheng Yazeng1，2Hou Shuo1，3Liu Guanshan1Wang Yuanying1
（1. Tobacco Research Institute of CAAS，Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology，CAAS，Qingdao266101；2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081；3. College of Agriculture and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109）

The polyacrylamide gel electrophoresis with high resolution is a top choice for isolating and purifying specific short DNA fragments， and also serves as a prerequisite for a variety of subsequent molecular biology experiments. In this study， three methods， i.e.，modified boiling method（grinding with liquid nitrogen + boiling + concentrating at low temperature）， traditional boiling method（in which DNA is precipitated with absolute ethanol and 3 mol/L sodium acetate together）， and direct recovery method were used to extract short DNA fragments. The short DNA fragments were used as the template for a second PCR reaction. The results showed that recovered DNA fragments by the modified boiling method had higher purity and finer specificity， and the recovery rate was nearly the same as the traditional boiling method. Replacing the method of precipitation with ethanol and sodium acetate by method of concentrating at low temperature is feasible and novel.

non-denaturing polyacrylamide gel；short DNA fragments；secondary PCR；modified boiling method；gel recovery

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.011

2014-08-27

公益行行業(yè)專項(xiàng)（201203091），國(guó)家煙草專賣局重點(diǎn)項(xiàng)目（110201002002）

向小華，男，博士研究生，研究方向：煙草分子育種；E-mail：xiangxiaohuacaas@163.com

王元英，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：煙草遺傳育種；E-mail：wyytob@126.com