郭剛 唐丹 田萍萍 石秀峰 曹鵬 高強(qiáng)

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院　工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300457）

基于GC-MS的阿維鏈霉菌代謝物組學(xué)研究方法的建立

郭剛 唐丹 田萍萍 石秀峰 曹鵬 高強(qiáng)

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

基于GC-MS分析平臺(tái)，建立了阿維鏈霉菌代謝物組樣品制備過(guò)程中的菌體分離、細(xì)胞清洗、細(xì)胞淬滅及代謝物提取條件，并對(duì)阿維菌素高產(chǎn)菌株和野生菌株胞內(nèi)代謝物組進(jìn)行了初步分析。采用“冷凍離心-細(xì)胞清洗（3次）-液氮淬滅（5 min）-珠磨破壁（3個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)48 s）-提取（氯仿∶乙醇∶水= 2∶2∶1）”的方法，可以定性和定量檢測(cè)阿維鏈霉菌胞內(nèi)包括氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、糖類等59種差異化合物。建立的方法能夠有效地用于阿維鏈霉菌胞內(nèi)代謝物的分析。

阿維鏈霉菌；代謝物組；破壁；提??；GC-MS

阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）產(chǎn)生的阿維菌素是一組高效、低毒、廣譜的殺蟲抗生素，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景［1］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)阿維鏈霉菌的高產(chǎn)機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究［2］，這些研究主要集中在基因水平和蛋白質(zhì)水平，而對(duì)阿維菌素產(chǎn)量低、副產(chǎn)物濃度過(guò)高等不利表型關(guān)注不多［3-5］。對(duì)于外界環(huán)境脅迫，細(xì)胞具有非常精妙和極其復(fù)雜的調(diào)控和適應(yīng)機(jī)制，不僅涉及到“上游”基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等水平的變化，還包括“下游”對(duì)于外界擾動(dòng)更加敏感的代謝物、代謝路徑和代謝網(wǎng)絡(luò)等層面的變化［6］。

代謝物組學(xué)（Metabolomics/Metabonomics）是對(duì)生物體內(nèi)所有相對(duì)分子質(zhì)量在1 000以內(nèi)的代謝物進(jìn)行定性和定量分析［7］，它是繼基因組學(xué)和蛋白學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的組學(xué)學(xué)科。其著重于全局分析和理解代謝網(wǎng)絡(luò)與動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以及代謝通路控制［8，9］。代謝物組學(xué)在定量分析系統(tǒng)生物學(xué)中扮演著重要的角色。在這一領(lǐng)域已經(jīng)建立了氣質(zhì)（GC-MS）、液質(zhì)（LC-MS）和核磁（NMR）等檢測(cè)手段［10］。

微生物代謝物組學(xué)需要高效可靠的樣品前處理，這樣才能夠確保胞內(nèi)代謝物分析的準(zhǔn)確性［9，11］。然而，最近許多科研工作者未進(jìn)行條件優(yōu)化，直接使用文獻(xiàn)報(bào)道的樣本前處理方法。為了確保樣品準(zhǔn)確反映生物體的特定狀態(tài)，研究合理有效的胞內(nèi)代謝物提取方法顯得尤為重要。常用的方法是在細(xì)胞懸液中加冷甲醇或其他有機(jī)溶劑，瞬間停止細(xì)胞的代謝［12］。但這個(gè)方法的缺點(diǎn)是，在淬滅過(guò)程中有機(jī)溶劑裂解細(xì)胞導(dǎo)致大量胞內(nèi)代謝物丟失［13］。另一種方法是將菌體從培養(yǎng)基中分離出來(lái)之前或之后用液氮進(jìn)行淬滅［9，13，14］。代謝物提取過(guò)程中，提取方法和提取溶劑對(duì)提取物的種類和含量有較大的影響。本試驗(yàn)著重研究了細(xì)胞分離過(guò)程中的細(xì)胞清洗次數(shù)、破壁方法（液氮研磨和珠磨法）、破壁次數(shù)和提取溶劑對(duì)代謝物提取的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 阿維鏈霉菌野生型（WT）和高產(chǎn)菌株（9-39）均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供。培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法見(jiàn)文獻(xiàn)［15］。

1.1.2 主要試劑 甲氧基銨鹽酸鹽（色譜純）與吡啶（色譜純），天津元立化工有限公司；N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（色譜純），Alfa Aesar化學(xué)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Precellys 24珠磨器，法國(guó)Bertin公司；LC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有7683自動(dòng)進(jìn)樣器與6980氣相色譜儀（GC，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 菌體制備及淬滅 取20 mL阿維鏈霉菌發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min，上清液-80℃凍存，用于后續(xù)分析。在離心后的細(xì)胞沉淀中加入4℃預(yù)冷的0.6% NaCl水溶液，震蕩，6 000 r/min、4℃離心5 min，取1 mL上清液-80℃凍存，用于后續(xù)分析，棄上層緩沖液保留下層細(xì)胞沉淀，反復(fù)3次，以去除細(xì)胞表面的培養(yǎng)基成分［16］。將清洗后的細(xì)胞置于液氮中，淬滅5 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞破碎和胞內(nèi)小分子提取

1.2.2.1 液氮研磨細(xì)胞破碎 將淬滅后的細(xì)胞液氮研磨20 min，至細(xì)粉狀，稱取50 mg于1.5 mL離心管中用于小分子代謝物的提取，每個(gè)取樣點(diǎn)取5個(gè)平行［17］。

1.2.2.2 珠磨法細(xì)胞破碎 將含有50 mg淬滅后細(xì)胞的離心管中加入1.5 g玻璃微晶，再加入1 mL預(yù)冷的提取液，混勻后珠磨處理1-3個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)48 s），液氮凍融，每次凍2 min，重復(fù)4次，4℃、10 000 r/min離心5 min，保留上清于新的離心管中。

1.2.2.3 胞內(nèi)小分子提取 液氮研磨后的樣品加入1 mL預(yù)冷的提取溶劑（60%冷乙醇溶液；4∶6的1 mmol/L富馬酸水溶液：甲醇；2∶2∶1（V/V）的氯仿∶乙醇∶水；60%沸乙醇［12，18］；60%冷甲醇溶液），渦旋1 min至勻，液氮凍融，每次凍2 min，重復(fù)4次［19］。熱乙醇法提?。?0%乙醇置于沸水浴10 min，取1 mL加入含有50 mg菌體的EP管中沸水浴5 min。細(xì)胞提取液10 000 r/min離心5 min，保留上清于新的離心管中。

1.2.3 樣品的衍生化 將上述提取液冷凍干燥后，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)80 min；（2）加80 μL N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)80 min；（3）將衍生后的樣品10 000 r/min離心5 min；取上清液100 μL加入進(jìn)樣瓶中，并編號(hào)，于室溫放置2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

1.2.4 GC/MS檢 測(cè) GC條 件［17］：Agilent HP5 30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：280℃，升溫程序：初始溫度70℃保持2 min，以5℃/min程序升溫至290℃保持5 min；載氣：高純氦氣，恒壓模式91 kPa，流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；柱后分流比10∶1。

MS條件［17］：接口溫度：280℃；電離方式：EI；電離方式：電子轟擊電離（EI+）；離子源溫度：250℃；電子轟擊能量：70 eV；電子電流：40 μA；掃描質(zhì)量范圍：50-800 m/z。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 將GC/MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入MSD增強(qiáng)型化學(xué)工作站，提取離子峰并用NIST08數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行定性，通過(guò)將所有的離子峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積相比使數(shù)據(jù)歸一化，再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化后導(dǎo)入SIMCA軟件進(jìn)行PCA分析［7，20］。

2 結(jié)果

2.1 菌體清洗

代謝物組研究過(guò)程中樣品的制備是非常重要的，胞內(nèi)代謝物組的研究過(guò)程中必須清洗菌體去除培養(yǎng)基成分。但細(xì)胞清洗過(guò)程中也存在胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。因此選擇合適的清洗劑和恰當(dāng)?shù)那逑创螖?shù)非常重要。為了確定最恰當(dāng)?shù)那逑创螖?shù)，GC-MS測(cè)定發(fā)酵液上清和4步清洗后的上清液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3步清洗可以將胞外代謝物和培養(yǎng)基成分完全去除（圖1）。

圖1 菌體清洗效率

2.2 細(xì)胞破碎

阿維鏈霉菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，使用有機(jī)溶劑無(wú)法將其細(xì)胞壁有效破碎，因此在提取胞內(nèi)物質(zhì)之前需要通過(guò)必要的機(jī)械方法來(lái)破壞細(xì)胞壁。液氮研磨法和珠磨法是常用的細(xì)胞膜破碎方法，這兩種方法可以在不引入其他物質(zhì)的前提下達(dá)到破碎的目的。

本研究分別利用這兩種破壁方法提取胞內(nèi)物質(zhì)，GC-MS檢測(cè)胞內(nèi)成分，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)入SIMCA進(jìn)行PCA分析（圖2）。從得分圖（圖2-A）中可以看出液氮研磨法和珠磨法提取的胞內(nèi)物質(zhì)存在明顯的差別，液氮研磨法在得分圖中比較分散，說(shuō)明液氮研磨法組內(nèi)誤差較大，這主要是由于人工研磨樣品不均一所致。從得分圖（圖2-B）對(duì)應(yīng)的載荷圖中可以看出，液氮研磨法和珠磨法主要的差別體現(xiàn)在17種物質(zhì)的提取效率上，對(duì)比這17種物質(zhì)相對(duì)峰值（圖3）可知，珠磨法提取的物質(zhì)相對(duì)量遠(yuǎn)大于液氮研磨法。

代謝物組研究過(guò)程中胞內(nèi)物質(zhì)的提取過(guò)程嚴(yán)重影響代謝分析的結(jié)果，為了研究珠磨法破壁效率，GC/MS測(cè)定珠磨1-3個(gè)循環(huán)的胞內(nèi)提取物并進(jìn)行PCA分析，將引起差異的主要物質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)隨著珠磨次數(shù)的增加，提取的胞內(nèi)物質(zhì)的量增加，但到3個(gè)循環(huán)時(shí)有部分物質(zhì)的提取量下降，因此確定珠磨兩個(gè)循環(huán)為最優(yōu)。

2.3 胞內(nèi)代謝提取

代謝物組數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，需要定性和定量盡可能多的物質(zhì)來(lái)全面的描述代謝途徑、代謝調(diào)節(jié)及描述機(jī)制。阿維鏈霉菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物GC/MS可檢測(cè)到的多達(dá)300多種，而這些物質(zhì)在同一溶劑中的溶解度不同。合適的萃提溶劑要求在提取過(guò)程中不能對(duì)代謝物進(jìn)行物理或者化學(xué)修飾，而且要盡可能多的提取代謝物。因此進(jìn)行試驗(yàn)和比較不同的提取劑對(duì)阿維鏈霉菌的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的提取是非常必要的。試驗(yàn)中比較的5種溶劑，見(jiàn)表1。

編號(hào)　　溶劑組成A 60%冷乙醇溶液B 1 mmol/L富馬酸水溶液：甲醇=4∶6 C氯仿∶乙醇∶水 = 2∶2∶1 D 60%沸乙醇E 60%冷甲醇

通過(guò)以上各種提取溶劑對(duì)阿維鏈霉菌代謝物的比較（圖5）可以明顯看出提取液C除了有3個(gè)相對(duì)峰值（乳酸、脯氨酸、亮氨酸）低于60%冷甲醇提取，其他峰值均明顯高于對(duì)照，因此2∶2∶1（V/V）的氯仿∶乙醇∶水更適合作為阿維鏈霉菌胞內(nèi)代謝物組的提取溶劑。

2.4 阿維鏈霉菌代謝物組分析

在建立了鏈霉菌代謝物組學(xué)研究方法后，為解析阿維鏈霉菌高產(chǎn)阿維菌素的機(jī)制，本研究對(duì)阿維鏈霉菌野生型（WT）和高產(chǎn)型（9-39）代謝物組進(jìn)行了分析。

通過(guò)得分圖（圖6-A）可以看出WT和9-39胞內(nèi)代謝物存在明顯的代謝差異。從載荷圖（圖6-B）可知，阿維鏈霉菌培養(yǎng)到第10天，9-39與WT胞內(nèi)物質(zhì)的主要差異來(lái)自糖類和部分氨基酸，9-39胞內(nèi)半乳糖、葡萄糖和纖維二糖水平高于WT，這與蛋白組學(xué)研究結(jié)果相一致［21］。此外，蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿維鏈霉菌高產(chǎn)菌株的糖代謝相關(guān)酶表達(dá)量高于野生菌株。本研究中高產(chǎn)菌株氨基酸類中的亮氨酸、丙氨酸、絲氨酸與賴氨酸代謝水平較高，這也與蛋白組學(xué)相關(guān)結(jié)果一致［21］。

圖2 液氮研磨法與珠磨法細(xì)胞破碎提取物PCA分析得分圖（A）和載荷圖（B）

圖3 液氮研磨法和珠磨法細(xì)胞壁破碎效率的比較

圖4 珠磨循環(huán)對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)提取效率的影響

圖5 不同提取溶劑對(duì)提取效果的影響

3 討論

阿維鏈霉菌作為阿維菌素的生產(chǎn)菌株，其代謝工程與合成生物學(xué)改造對(duì)進(jìn)一步提高阿維菌素產(chǎn)量具有重要意義。在改造過(guò)程中，代謝物組學(xué)作為一種系統(tǒng)的研究手段，在目的產(chǎn)物相關(guān)代謝物的發(fā)現(xiàn)中具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，在微生物代謝物組學(xué)研究方面取得了巨大的進(jìn)步，但尚無(wú)阿維鏈霉菌代謝組學(xué)研究方法的文獻(xiàn)報(bào)道，而現(xiàn)存的代謝物組學(xué)研究方法中沒(méi)有一種可以適用于所有微生物。這就要求人們?cè)谥苽錅?zhǔn)確反映細(xì)胞生理狀態(tài)的代謝物時(shí)，不能采用與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等相同的方法。所以本研究主要對(duì)阿維鏈霉菌代謝物樣品制備步驟進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。

細(xì)胞清洗能夠去除培養(yǎng)基和胞外代謝物對(duì)胞內(nèi)代謝物組的影響。由于胞外代謝物和培養(yǎng)基成分復(fù)雜，清洗不完整會(huì)嚴(yán)重影響胞內(nèi)代謝物組的測(cè)定，而清洗過(guò)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁受損嚴(yán)重，胞內(nèi)代謝物大量滲漏，致使獲得的代謝物數(shù)目顯著減少。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞清洗3次能夠在不導(dǎo)致細(xì)胞破裂的情況下完全去除培養(yǎng)基和胞外物質(zhì)。液氮反復(fù)凍融是提取胞內(nèi)代謝物的主要方法，但對(duì)于具有較厚細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及真菌，反復(fù)凍融法通常不能充分提取其胞內(nèi)代謝物。為了解決這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室研究液氮研磨和珠磨法這兩種破碎細(xì)胞壁的方法發(fā)現(xiàn)，珠磨法比液氮研磨法能夠有效地破碎細(xì)胞壁。此外，研究還發(fā)現(xiàn)珠磨兩個(gè)循環(huán)可以充分提取胞內(nèi)物質(zhì)。代謝物組數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，需要定性和定量盡可能多的物質(zhì)來(lái)全面的描述代謝途徑、代謝調(diào)節(jié)及描述機(jī)制。由于代謝物在不同的提取溶劑中的提取效率不同，本研究比較了5種提取溶劑的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇∶氯仿∶水 = 2∶2∶1（V/V）的比例提取的胞內(nèi)的代謝物質(zhì)最全面，而且提取含量最高。通過(guò)對(duì)各樣品制備環(huán)節(jié)進(jìn)行比較優(yōu)化，最終得到了最適合阿維鏈霉菌代謝物分析樣品的制備方法。

圖6 阿維鏈霉菌胞內(nèi)代謝物PCA分析得分圖（A）和載荷圖（B）

4 結(jié)論

利用本試驗(yàn)室建立的阿維鏈霉菌代謝物組學(xué)樣品制備方法，對(duì)阿維菌素高產(chǎn)菌株（9-39）和野生菌株（WT）代謝物相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了分析，高產(chǎn)菌株的糖代謝和部分氨基酸代謝旺盛，這與蛋白組學(xué)研究的結(jié)果相吻合。因此本試驗(yàn)室建立的代謝物提取分析方法適用于阿維鏈霉菌代謝物組研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimized Sample Preparation for Metabolome Studies on Streptomyces avermitilis by GC-MS

Guo Gang Tang Dan Tian Pingping Shi Xiufeng Cao Peng Gao Qiang
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin300457）

We established a method for preparing metabolome sample of Streptomyces avermitilis， including cell separation， washing，quenching， disruption and extraction conditions based on GC-MS analysis system， and applied it in the analysis of the metabolome of industrial strain 9-39 and wild type strain. The optimal conditions for sample preparation were as follows: separating cells by centrifugation， washing 3 times， quenching 5 minutes with liquid nitrogen， cell disruption with bead mill（3 cycles and 48 seconds per each cycle）， and extraction of metabolites（chloroform∶ethanol∶water = 2∶2∶1）. By using this optimized protocol， 59 differential compounds were identified and quantified， including amino acids， organic acids， fatty acids and saccharides. Our established method can be used to effectively analyze the Streptomyces avermitilis metabolites.

Streptomyces avermitilis；metabolomics；cell disruption；extraction；GC-MS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.010

2014-09-24

國(guó)家“973”項(xiàng)目（2013CB734004），國(guó)家“863”項(xiàng)目（2012AA021302），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370075，31471725）

郭剛，男，碩士研究生，研究方向：生物制藥；E-mail：guogangx@163.com

高強(qiáng)，男，教授，研究方向：代謝控制發(fā)酵；E-mail：gaoqiang@tust.edu.cn