李行任，羅楊合，韋琳，韋學(xué)豐，高志明

（賀州學(xué)院桂東特色資源研究與開發(fā)廣西高校重點實驗室，廣西賀州542899）

荸薺皮總黃酮的純化及其抗氧化活性研究

李行任，羅楊合*，韋琳，韋學(xué)豐，高志明

（賀州學(xué)院桂東特色資源研究與開發(fā)廣西高校重點實驗室，廣西賀州542899）

利用大孔吸附樹脂純化荸薺皮總黃酮，探討總黃酮的純化條件，并通過總抗氧化性能試驗、ABTS試驗和DPPH試驗評價了總黃酮抗氧化活性。試驗結(jié)果表明，用乙醇水溶液梯度洗脫D101大孔吸附樹脂，獲得純度高、抗氧化活性好的荸薺皮總黃酮，黃酮收率為58.52%，純度為70.64%。所得總黃酮具有良好的還原能力，為0.60 mmolTE（Trolox當(dāng)量）/g，和良好的ABTS·+、DPPH自由基清除活性，IC50分別為1.86、0.49 mmolTE/g，其中ABTS·+自由基清除性能均大于對照物Trolox和蘆丁，DPPH自由基清除性能大于蘆丁。

荸薺皮；總黃酮；純化；大孔吸附樹脂；抗氧化活性

荸薺（Eleocharis tuberosa）是莎草科荸薺屬水生植物的地下球莖，是深受歡迎的藥食兩用果蔬，在我國大部分地區(qū)廣泛種植，因其豐富的營養(yǎng)和特別的藥用價值而受到廣泛的關(guān)注［1］。荸薺含有豐富的活性物質(zhì)，存在荸薺果皮與果肉之間，其果皮的提取物富含黃酮和酚類物質(zhì)［2-3］，也具有良好的抑菌作用［4］和抗氧化活性［5］。目前報道荸薺皮黃酮的文獻只局限于荸薺皮提取物及其相關(guān)應(yīng)用的研究［2，4-6］，而荸薺皮提取物的成分復(fù)雜，除含黃酮外，還含其他的成分［3］，鮮有文獻報道其黃酮的純化。隨著荸薺產(chǎn)品的需求增加，廢棄荸薺皮更容易獲得，開發(fā)荸薺皮黃酮相關(guān)的產(chǎn)品成為可能。黃酮具有的多種活性都與人類的疾病息息相關(guān)，其極強的抗氧化性能，使富含黃酮的荸薺皮更受人們的關(guān)注，更深入開發(fā)和應(yīng)用荸薺皮黃酮產(chǎn)品成為需要［2］。本課題純化了荸薺總黃酮，獲得純度高、抗氧化活性好黃酮產(chǎn)品，對荸薺皮活性成分的開發(fā)與應(yīng)用具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

荸薺皮：收集自賀州市市場，剔除腐爛部分，洗凈，晾干，粉碎，備用。X-5、D101、NKA-9和AB-8大孔樹脂：天津市光伏精細化工研究所；蘆丁（為生化試劑）：購自中國食品藥品檢定研究院；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、1，1-苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-氨基-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）：Sigma-Aldrich公司；其余試劑為分析純。SP-722分光光度計：上海光譜儀器有限責(zé)任公司。

1.2大孔樹脂純化荸薺皮總黃酮

1.2.1大孔樹脂預(yù)處理

大孔樹脂加入錐形瓶中，用無水乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗至流出液加水無白色渾濁為止，然后用蒸餾水洗至無醇味，過濾，常溫下保存，備用。

1.2.2荸薺皮總黃酮粗液的制備

荸薺皮粉末（20.0 g），加入50%丙酮（700 mL×2），在60℃下提取1.5 h，提取2次。過濾，濃縮至干，獲得總黃酮粗品［3］。將粗品溶于10%甲醇，并調(diào)節(jié)其黃酮含量在0.11 mg/mL～0.88 mg/mL之間，在低溫避光保存，2 d內(nèi)使用。

1.2.3分析與計算

提取液和成品的黃酮含量按文獻的方法［6］測定；

1.2.4靜態(tài)吸附選擇大孔樹脂

使用不同類型的樹脂吸附相同的粗黃酮溶液來評價大孔樹脂的吸附性能，通過樹脂的靜態(tài)吸附率來選擇吸附較好的樹脂。取預(yù)處理過的樹脂5.00 g，加入含量為0.22 mg/mL的荸薺皮提取液50 mL，在25℃下浸泡24 h。測定上清液的吸光度，計算吸附率。

1.2.5靜態(tài)吸附動力學(xué)

準確稱取已選用的大孔樹脂5.00 g，裝入100 mL具塞磨口錐形瓶中，加入含量為0.22 mg/mL的黃酮粗提液50 mL，在25℃下恒溫震蕩器上震蕩，每20 min取上清夜測定黃酮含量，直到達到平衡為止。作出吸附率-時間曲線。

1.2.6最大吸附量的確定

稱取經(jīng)預(yù)處理過的大孔樹脂5.00 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加入黃酮濃度為0.22 mg/mL的荸薺皮粗提物25、50、75、100 mL，于25℃震蕩吸附12 h，測定黃酮含量，總吸附率為最大吸附量。

1.2.7靜態(tài)解吸考察乙醇濃度的解吸率

各取適量已吸附荸薺皮黃酮的樹脂，分別加入10體積的不同濃度的乙醇水溶液（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），震蕩12 h后過濾，取濾液測定黃酮含量?？疾觳煌瑵舛纫掖嫉慕馕省?/p>

1.2.8動態(tài)等度洗脫

取適當(dāng)活化的樹脂裝柱（30 cm×50 cm），將荸薺皮黃酮原液按最大吸附量上柱，靜態(tài)吸附6 h后水洗至FeCl3顯色不明顯，按最大解吸率的乙醇濃度洗至吸光度至FeCl3顯色不明顯。考察樹脂的解吸率與時間的關(guān)系。

1.2.9動態(tài)梯度洗脫

取適當(dāng)活化的樹脂裝柱（30 cm*70 cm），將荸薺皮黃酮原液按最大吸附量上柱，靜態(tài)吸附6 h后水洗至FeCl3顯色不明顯，按不同的乙醇濃度（10%、30%、50%、70%和100%）洗至吸光度至FeCl3顯色不明顯，換下一濃度。洗脫液濃縮，測定黃酮含量，計算回收率。

1.3抗氧化活性測定

1.3.1ABTS陽離子自由基清除活性的測定（TECA）

荸薺皮黃酮的ABTS陽離子自由基清除活性通過文獻［7］描述的方法評價。含2.45 mmol/L過硫酸鉀的ABTS水溶液（7 mmol/L）在室溫下放置12 h～16 h，然后用磷酸緩沖溶液PBS（pH 7.4）稀釋至在734 nm的吸光度為0.7（±0.02）。不同濃度的樣品（0.1 mL）或Trolox的乙醇溶液（最終濃度為0 μmol/L～15 μmol/L）或PBS溶液加入到1.9 mL ABTS·+溶液，搖勻，30℃水浴中加熱6 min后，測定溶液在734 nm處的吸光度。蘆丁乙醇溶液為正相控制。ABTS清除率（%）：I%=［1-（Asample/Ablank）］×100。黃酮的清除活性用mmol/gTrolox當(dāng)量表示。

1.3.2DPPH自由基清除活性的測定

清除DPPH能力根據(jù)Rodrigo Scherer和Helena Teixeira Godoy［8］描述的方法測定。在不同濃度0.1 mL樣品溶液或空白（乙醇）中，加入3.9 mL DPPH乙醇溶液（0.080 mmol/L），搖勻，在37℃水浴中避光加熱30 min，在517 nm下測定吸光度。Trolox和蘆丁為參考。清除率：I%=［1-（Asample/Ablank）］×100，作出曲線，求得IC50值。樣品活性用mmol/g Trolox當(dāng)量表示。

1.3.3還原能力的測定

荸薺皮黃酮的還原能力測定參考文獻［9］描述的方法。樣品溶液（1mL，0.1mg/mL60%乙醇溶液），加入磷酸緩沖溶液（PBS，2.5 mL，0.2 mmol/L，pH 6.6）、K3Fe（CN）6（2.5mL，10mg/mL），搖勻，在50℃水浴中加熱20min，然后加入2.5mL三氯乙酸（100mg/mL），在轉(zhuǎn)速2000r/min下離心10 min。取2.5 mL上清液，加入蒸餾水（2.5 mL）和FeCl3（0.5 mL，1.0 mg/mL），測定其700 nm處的吸光度。蘆丁乙醇溶液（10 μmol/L）和不同濃度的Trolox乙醇溶液（0 mmol/L～0.2 mmol/L）為正相控制。還原能力用mmol/g Trolox當(dāng)量表示。

2　結(jié)果與討論

2.1荸薺皮總黃酮的純化

2.1.1靜態(tài)吸附選擇大孔樹脂

由于黃酮提取液蒸除乙醇后，有固體顆粒出現(xiàn)，不能完全分散在水中，直接過濾將損失部分黃酮，直接使用后發(fā)現(xiàn)解吸后的總黃酮含量高于原液。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，用10%甲醇溶解后過濾，獲得澄清的黃酮粗液，但對吸附率有一定的影響。不同類型的大孔樹脂的吸附結(jié)果如表1所示。

表1　不同樹脂對荸薺皮總黃酮的靜態(tài)吸附結(jié)果Table 1The results for resins on static adsorption of chufa peels total flavonoids

由表1可看出D101的吸附率最高，為88.12%，AB-8次之。選擇D101為純化樹脂。

2.1.2靜態(tài)吸附動力學(xué)結(jié)果

D101大孔樹脂對黃酮靜態(tài)吸附的動力學(xué)結(jié)果如圖1所示。

圖1　D101對黃酮的靜態(tài)吸附動力學(xué)結(jié)果Fig.1The kinetics result for D101 on static adsorption of flavonoids

樹脂的吸附速率與黃酮的濃度有關(guān)［10］；剛開始時，樹脂的吸附速度很快，隨著黃酮濃度減少和樹脂吸附黃酮量的增加，吸附速率下降，30 min后吸附速率開始變緩，200 min后基本不變化，樹脂的吸附能力已被消耗。從圖可知，D101樹脂對荸薺皮黃酮有快速的吸附能力，吸附率達82.06%，在生產(chǎn)上有利于縮短時間，降低生產(chǎn)成本。

2.1.3最大吸附量的測定結(jié)果

D101樹脂對荸薺皮黃酮的總吸附量結(jié)果如圖2。

圖2　最大吸附量的測定結(jié)果Fig.2The result of maximum adsorption content

由圖2可知，隨著黃酮溶液體積的增大，樹脂的吸附量也增加，但是黃酮的吸附率下降?？梢姡邼舛鹊狞S酮溶液會增大樹脂的吸附量；而在實際生產(chǎn)中，低的吸附率會浪費黃酮原料，增加成本。故采用最大吸附率的前提下，增加吸附量是較好的選擇。在10 BV時，吸附率最大，為83.87%，總吸附率為1.84 mg/g，黃酮吸附趨于吸附飽和。

2.1.4不同乙醇濃度的靜態(tài)解吸結(jié)果

不同濃度的乙醇對飽和黃酮樹脂的靜態(tài)解吸結(jié)果見圖3。

圖3　不同濃度的乙醇對黃酮的靜態(tài)解吸結(jié)果Fig.3The results for different concentration of ethanol on static desorption of flavonoids

荸薺皮提取物含有黃酮及其苷，乙醇濃度低時，部分黃酮苷被解吸；乙醇濃度過高，解吸能力下降；50%乙醇對荸薺皮黃酮具有最好的解吸效果，解吸率為80.10%。

2.1.5等度洗脫結(jié)果

50%乙醇對黃酮的等度洗脫結(jié)果如圖4所示。

圖4　等度洗脫結(jié)果Fig.4The result of isocratic elution for flavonoids

由圖4可見，該濃度的乙醇在20 min前的解吸率上升較快，黃酮容易洗脫；隨后變緩，到100 min后解吸率基本沒有發(fā)生變化。黃酮的解吸時間短，有利于黃酮的生產(chǎn)，但也降低了樹脂的分離效果，得不到高純度的荸薺皮黃酮。

2.1.6梯度洗脫結(jié)果

等度洗脫大孔樹脂所得黃酮的純度低，改用梯度洗脫純化。梯度洗脫液經(jīng)濃縮后，測定所得組分的黃酮含量，用回收率表示，結(jié)果見表2。

表2　梯度洗脫結(jié)果Table 2The results for gradient elution for flavonoids

由表2可知，大部分黃酮集中在50%乙醇洗脫液中，黃酮回收率為50.07%，其質(zhì)量為0.25 g，黃酮純度為70.52%；30%乙醇次之，回收率為18.42%，其質(zhì)量為0.18 g，黃酮純度為35.13%。將黃酮純度高的部分合并，獲得黃酮產(chǎn)品0.25 g，回收率為58.52%，純度為70.64%。可見，梯度洗脫時用極性大的洗脫劑，將極性大的糖類物質(zhì)除去，改用最大解吸率的洗脫劑，能獲得純度高的荸薺皮總黃酮。梯度洗脫，能有針對性地分離不同極性的黃酮，對研究總黃酮的成分和性質(zhì)、提高黃酮的品質(zhì)及其開發(fā)應(yīng)用有很大的幫助。

2.2抗氧化活性測定結(jié)果

抗氧化活性測定結(jié)果見表3。

表3　抗氧化活性試驗結(jié)果Table 3The results of antioxidant activities assay

2.2.1ABTS·+陽離子自由基清除活性

ABTS·+陽離子自由基在溶液中與抗氧化劑反應(yīng)迅速，適用于pH范圍大的溶液中，且ABTS·+活性測試發(fā)生在多種介質(zhì)中，可測定水溶性、脂溶性的提取物、天然純化合物和合成的抗氧化劑［11］。荸薺皮提取物和總黃酮的IC50分別為26.24 mg/L和5.89 mg/L，其Trolox當(dāng)量分別為0.42 mmolTE/g和1.86 mmolTE/g（見表3）。純化后荸薺皮總黃酮的清除ABTS的能力是純化前的4.43倍，大于Trolox和蘆丁的清除能力，具有較強的ABTS自由基清除活性。

2.2.2DPPH自由基清除活性

DPPH離子在溶液中穩(wěn)定，反應(yīng)快速，是通過測定溶液中吸光度的減少來獲得抗氧化劑的清除活性，經(jīng)常用于測定經(jīng)典抗氧化劑的清除自由基活性［12］。荸薺皮提取物和總黃酮的IC50分別為112.2mg/L和13.08mg/L，其Trolox當(dāng)量分別為0.058 mmolTE/g和0.49 mmolTE/g（見表3）?？傸S酮純化后清除DPPH的能力大于蘆丁的，比Trolox的小，為強的抗氧化劑。

2.2.3還原能力

硫氰化鉀還原法用于測定抗氧化劑的總還原能力。K3Fe（CN）6絡(luò)合物中的Fe3+經(jīng)抗氧化劑還原，轉(zhuǎn)化為Fe2+的形式，形成布魯士蘭，在700 nm有最大吸收［13］。0.2 mg/mL的荸薺皮提取液和總黃酮的吸光度分別為0.18和0.47，其Trolox當(dāng)量分別為0.20 mmolTE/g和0.60 mmolTE/g（見表3）。經(jīng)純化后，總黃酮的還原能力有較大的提高，具有很強的抗氧化還原能力。

3　結(jié)論

通過大孔樹脂純化荸薺皮總黃酮，獲得純度高、抗氧化活性好的黃酮，收率為58.52%。荸薺皮總黃酮經(jīng)純化后，抗氧化能力有大幅提高，具有強的還原氧化能力和清除ABTS和DPPH自由基活性。荸薺皮富含不同種類的黃酮化合物，這是由于這些化合物良好的抗氧化能力及其之間的協(xié)同作用，使荸薺能防御因氧化劑引起的機體損傷［14］。將荸薺皮黃酮開發(fā)成為食品添加劑應(yīng)用于食品加工，其產(chǎn)品將使人們更容易獲得日常攝入量的天然抗氧化劑來抵抗由自由基引起的相關(guān)疾?。?5］。在國內(nèi)，荸薺淀粉和罐頭的需求越來越大，其附屬的副產(chǎn)品荸薺皮更容易獲得，大量廢棄的荸薺皮本身是一種資源的浪費。因此，開發(fā)和生產(chǎn)荸薺皮黃酮相關(guān)的產(chǎn)品，將使人們更易獲得健康的天然抗氧化劑成為可能。

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Purification and Antioxidant Activities of Total Flavonoids from Chufa（Eleocharis tuberosa）Peels

LI Xing-ren，LUO Yang-he*，WEI Lin，WEI Xue-feng，GAO Zhi-ming
（Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Characteristic Resources Development and Utilization Research in East Guangxi，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

Total flavonoids form chufa（Eleocharis tuberosa）peels were purified by macroporous adsorption resin，their antioxidant activities were evaluated by reducing power assay，ABTS assay and DPPH assay.The fine flavonoids with high purity and strong antioxidant activities were obtained using the D101 macroporous resin washed with gradient aqueous ethanol.The yield of flavonoids was 58.52%，and the purity was 70.64%.The purified flavonoids showed very strong reducing power，which was 0.60 mmol TE/g，and strong free radical scavenging activities against ABTS·+and DPPH，the IC50of which were 1.86 and 0.49 mmolTE/g.Their scavenging ABTS·+capacities were stronger than those of Trolox and rutin，and scavenging DPPH activities were stronger than that of rutin at the same concentrations.

chufa peels；total flavonoids；purification；macroporous adsorption resin；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.001

2014-01-22

國家自然科學(xué)基金（21365011）；廣西自然科學(xué)基金（2011GXNSFB018024）；廣西高校重點資助科研項目（201202ZD092）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（桂科攻，11107010-3-9）；廣西高?？蒲许椖浚?013ZL086、YB2014372）

李行任（1982—），男（漢），助理研究員，碩士，從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。