陶海英，閆鳴艷，尹利端

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南250100；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003；3.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東煙臺264006）

刺參內(nèi)臟蛋白酶解液抗氧化活性研究

陶海英1，閆鳴艷2，*，尹利端3

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南250100；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003；3.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東煙臺264006）

采用小鼠D-半乳糖致衰老模型，通過測定小鼠肝臟和心臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量，進一步研究了刺參內(nèi)臟蛋白酶解物酶解物的抗氧化活性。表明灌胃200 mg/kg·d酶解物可明顯提高小鼠肝臟和心臟中SOD和GSH-Px活力，并顯著降低MDA含量。說明刺參內(nèi)臟蛋白酶解物在一定程度上能夠提高D-半乳糖模型衰老小鼠的抗氧化能力。

刺參；內(nèi)臟，；酶解液，；抗氧化活性

刺參是一種高蛋白、低脂肪的無脊椎動物，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值，被列為海產(chǎn)“八珍”之一，深受人們的喜愛［1］。近年來，隨著人們生活水平和保健意識的提高，其養(yǎng)殖、生產(chǎn)和銷售規(guī)模逐漸擴大，由此產(chǎn)生大量的下腳料，如內(nèi)臟（腸、卵等）。研究發(fā)現(xiàn)這些下腳料含有豐富的蛋白質(zhì)［2］，是制備生物活性肽的理想原料，然而這些下腳料并未得到有效利用，大部分被丟棄，造成環(huán)境污染和資源的浪費。目前已有由海參加工下腳料制備多肽的研究報道，閆鳴艷等以刺參內(nèi)臟蛋白為原料通過菠蘿蛋白酶以及菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)配的方法制備了抗氧化肽，并研究了其脫色脫腥工藝［3-5］；楊濤等利用堿性蛋白酶酶解海參內(nèi)臟，發(fā)現(xiàn)其多肽具有較好的清除羥自由基和超氧陰離子自由基能力［6］；曹榮、李冬燕等對海參腸的酶解工藝及多肽的體外抗氧化活性進行了研究［7-8］。然而這些研究大多集中在多肽的制備工藝上，關(guān)于多肽的生物活性方面甚少全面研究。因此，本文以菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)配的方法制備刺參內(nèi)臟蛋白酶解液，通過研究小鼠D-半乳糖模型動物實驗，評價酶解液的體內(nèi)抗氧化活性，為海參內(nèi)臟多肽在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料儀器

刺參內(nèi)臟：山東東方海洋科技股份有限公司提供，-20℃保存，實驗時4℃解凍。

食品級堿性蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；食品級胰蛋白酶：湖北康寶泰精細化工有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH·）、D-半乳糖：Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、蛋白測定試劑盒（考馬斯亮藍法）：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。實驗動物昆明種小白鼠60只，清潔級，30日齡～35日齡，體重28 g～31 g，雄性，由山東綠葉制藥有限公司提供。

高速臺式冷凍離心機（TGL-16M）：長沙湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；精密增力電動攪拌器（JJ-1）：江蘇金壇市雙捷實驗儀器廠；電子天平（AL204-IC）：梅特勒-托利多儀器有限公司；紫外可見分光光度計（721E）：上海光譜儀器有限公司；pH計（PHS-3C）：上海虹益儀器儀表有限公司；DY89-1電動玻璃均漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1刺參內(nèi)臟蛋白酶解液的制備

刺參內(nèi)臟蛋白酶解液制備方法參照文獻［4］。精確稱取一定量的刺參內(nèi)臟，用6倍的蒸餾水勻漿，混合均勻，用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 6.3，加入菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶（總加酶量8 000U/g，二者酶活力配比為1∶3），在35℃條件下攪拌，水解2 h。水解結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，終止反應(yīng)，然后冷卻至室溫，置于離心機中，8 000 r/min離心30 min，收集上清液，通過10 kDa的賽多利斯超濾膜后減壓濃縮，凍干得到刺參內(nèi)臟蛋白酶解物。

1.2.2動物實驗

1.2.2.1昆明種小鼠亞急性衰老模型的建立

將昆明種小鼠60只適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分組分為正常對照組，衰老模型組，陽性對照組和酶解物給藥高、中、低劑量組，每組10只。酶解物給藥組、陽性對照組與衰老模型組按100 mg/kg bw·d每日頸背部皮下注射D-半乳糖，注射量為0.1 mL/10g·bw，正常對照組每天注射等量生理鹽水，連續(xù)注射42 d。造模同時灌胃給藥。酶解物給藥組每天按200、100、50 mg/kg·d高、中、低3個劑量灌胃給藥，灌胃體積均為25 mL/kg；陽性藥物組（VE）每天50 mg/kg·d灌胃給藥；衰老模型組與正常對照組每日灌服等量生理鹽水。每周根據(jù)體重調(diào)整給藥量，每日給藥1次，連續(xù)42 d。

1.2.2.2一般情況觀察

每天觀察動物外觀體征、被毛、精神狀態(tài)、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀、生殖器、死亡等情況并作記錄。每周稱量1次體重。

1.2.2.3抗氧化指標檢測

實驗小鼠于末次給藥后，禁食16 h脫臼處死。迅速取肝臟、心臟置于4℃生理鹽水中，洗凈表面殘留血跡，用濾紙吸干，立即稱濕重，加入預(yù)冷的生理鹽水，高速勻漿，離心取上清液，檢測SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

SOD的測定采用黃嘌呤氧化酵法。黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)將產(chǎn)生超氧自由基（O2-），后者氧化輕胺形成亞確酸鹽，通過顯色劑的作用呈現(xiàn)出紫紅色。當被測樣品中含超氧氣化物歧化酶時，則對超氧自由基有專一性的抑制作用，減少其亞稍酸鹽的生成，比色時對照管吸光度值高于測定管吸光度值，通過計算公式可得出樣品的SOD活力。將已經(jīng)處理好的10%組織勻柴上清液，用生理鹽水將其稀釋為1%，根據(jù)試劑盒的要求操作，依次加入各試劑、樣品于10 mL的EP管中，禍旋儀混勾。立即放入37℃恒溫水浴鍋中40 min（秒計時），取出后迅速加入顯色劑混勻于室溫靜止10 min后于波長550 nm比色測定其吸光度值。

GSH-Px可促進過氧化氧（H2O2）與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成水（H2O）及氧化型谷胱甘肽，用酶促反應(yīng)的速度來表示其GSH-Px的活力。測定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽（GSH）的消耗，則可通過計算得到酶的活力。最佳取樣濃度可分別取用10%、5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%的組織勻漿200 μL進行預(yù)試驗，按照試劑盒操作說明，從不同的濃度組織上清液中取出0.2 mL進行檢測，得出最佳濃度為1%。制備好最佳濃度1%的各組織上清液，根據(jù)試劑盒的操作加入各試劑和樣本，充分混勻，離心（4 000 r/min，10 min），取出上清液1 mL作顯色反應(yīng)。其顯色反應(yīng)中需加入GSH標準品應(yīng)用液及試劑盒的其他各試劑，渦旋儀混勻，于室溫靜止15 min后，412 nm測定各管的吸光度。

MDA的測定釆用TBA法。發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中最后產(chǎn)物（MDA）能與硫代巴比妥酸結(jié)合，在此過程中產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物于532 nm處具有最大吸收峰。根據(jù)試劑盒的說明操作，在測定管中加入0.1 mL準備好的組織勻漿的上清液標準管中，加入相同體積的濃度為10 nmol/mL的標準品，其空白管則加入無水乙醇，然后依次加入各試劑，渦旋儀混勻后，蓋上蓋子，放入95℃水浴鍋中40 min（秒表計時），取出各管立即流水冷卻離心（4 000 r/min、10 min）。輕吸上清（請勿吸到沉淀），在532 nm處測定各管的吸光值。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2結(jié)果與分析

2.1刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠生長和體重的影響體重是機體健康的重要指標，它也是反映疾病嚴重程度的重要指標，體重增加或減少過快都說明身體健康指數(shù)下降。體重在短期內(nèi)丟失10%以上，很有可能有潛在的腫瘤發(fā)生。試驗期間，所有給藥組動物一般狀態(tài)良好，試驗期間，模型組與正常對照組、各給藥組與模型組動物體重比較，未見統(tǒng)計學差異（見表1）。說明刺參內(nèi)臟蛋白酶解物未影響小鼠的正常生長，沒有任何毒副作用，同時皮下注射D-半乳糖沒有導(dǎo)致小鼠發(fā)生嚴重病變，注射劑量合適。

表1　小鼠試驗期間體重變化（±SD）Table 1Weight changes of mice during the experiment（±SD）

表1　小鼠試驗期間體重變化（±SD）Table 1Weight changes of mice during the experiment（±SD）

小鼠體重/g試驗前試驗1周試驗2周試驗3周試驗4周試驗5周試驗6周正常對照組29.24±1.8535.37±1.2639.02±2.0141.76±2.1542.62±1.8444.15±3.1046.26±3.97模型組29.80±2.3535.32±1.1038.80±2.3940.64±1.6942.16±1.8144.24±2.7946.06±2.69酶解物低劑量組30.32±1.6735.27±1.6038.47±1.7440.89±2.8542.23±2.0843.03±2.2845.87±3.50酶解物中劑量組30.15±1.7335.56±1.7638.13±1.9639.97±1.2642.03±2.2943.78±2.8746.04±2.21酶解物高劑量組29.24±2.0034.85±2.2038.19±2.3040.03±2.4341.99±2.4543.49±3.5445.78±4.60陽性對照組30.57±1.9635.36±2.6438.21±3.1239.86±2.8241.66±2.7943.61±3.1545.99±4.28組別

2.2刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器SOD活力的影響

超氧化物歧化酶（SOD）活力可以間接反映機體清除自由基的能力，它是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能專一性清除超氧陰離子自由基，當其活性下降時，會引起自由基產(chǎn)生過量，加速機體衰老［9］。表2為各實驗組小鼠肝臟和心臟中SOD活力測定結(jié)果。

表2　刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器SOD活力的影響（±SD）Table 2Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on SOD activities in mice organs（±SD）

表2　刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器SOD活力的影響（±SD）Table 2Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on SOD activities in mice organs（±SD）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

心臟SOD/（U/mg prot）正常對照組67.45±7.7621.62±3.26模型組44.99±5.19##13.14±2.54##酶解物低劑量組42.35±5.5513.03±2.67酶解物中劑量組50.87±6.41*16.36±3.86*酶解物高劑量組57.24±7.29**16.61±3.64*陽性對照組62.97±9.51**17.88±3.20**組別肝臟SOD/（U/mg prot）

可以看出模型組小鼠臟器SOD活力極顯著低于正常對照組（P＜0.01），表明實驗中小鼠衰老模型制備成功。同時酶解物中劑量組小鼠肝臟的SOD活力顯著高于模型組（P＜0.05），高劑量組極顯著高于模型組（P＜0.01），并與陽性對照組相當；另外酶解物中高劑量組小鼠心臟的SOD活力也顯著高于模型組（P＜0.05），表明刺參內(nèi)臟蛋白酶解物在一定劑量下有提高SOD活力的作用。

2.3刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，有清除過氧化物和保護細胞免于氧化損傷的重要作用，其活性的變化可反映機體抗氧化能力的變化［10］。刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響如表3所示。

表3　刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響（±SD）Table 3Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on GSH-Px activities in mice organs（±SD）

表3　刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響（±SD）Table 3Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on GSH-Px activities in mice organs（±SD）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

心臟GSH-Px（活力單位）正常對照組262.99±36.34315.08±34.23模型組180.70±29.83##244.42±25.48##酶解物低劑量組182.72±28.43245.96±20.97酶解物中劑量組200.81±14.02273.64±33.35*酶解物高劑量組228.01±23.15**278.85±38.95*陽性對照組241.46±22.90**286.20±34.85**組別肝臟GSH-Px（活力單位）

模型組小鼠肝臟和心臟GSH-Px活性極顯著低于正常對照組（P＜0.01），進一步表明實驗中小鼠衰老模型制備成功。酶解物高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活性極顯著高于模型組（P＜0.01），并與陽性對照組相當，但均低于正常對照組；同時酶解物中高劑量組小鼠心臟GSH-Px活性顯著高于模型組（P＜0.05），表明刺參內(nèi)臟蛋白酶解物在一定劑量下可延緩GSH-Px活性的降低。

2.4刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響

刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響見表4。

3結(jié)論

以D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠為模型進一步驗證了刺參內(nèi)臟蛋白酶解物的抗氧化活性。每天灌胃200 mg/kg·d的酶解物可明顯提高小鼠肝臟和心臟中SOD和GSH-Px活力，并顯著降低MDA含量。

體內(nèi)抗氧化實驗證實了刺參內(nèi)臟蛋白酶解液具有優(yōu)良的抗氧化活性，有作為活性成分添加到食品、化妝品中的應(yīng)用前景。

表4　刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響（±SD）Table 4Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on MDA contents in mice organs（±SD）

表4　刺參內(nèi)臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響（±SD）Table 4Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on MDA contents in mice organs（±SD）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

心臟MDA（nmol/mgprot）正常對照組6.21±1.098.44±1.25模型組9.26±1.14##19.59±3.91##酶解物低劑量組9.24±1.0420.12±3.12酶解物中劑量組8.30±0.8816.21±3.42酶解物高劑量組7.84±1.10*13.26±2.08**陽性對照組（VE）7.65±1.49*10.97±1.96**組別肝臟MDA（nmol/mgprot）

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量機體衰老過程中脂質(zhì)過氧化的重要指標，反映了機體受損程度，其含量越高，表明脂質(zhì)過氧化程度越高［10］。從表4可以看出，模型組小鼠肝臟和心臟中的丙二醛含量明顯高于正常組（P＜0.01），分別增加了49%和132%，說明皮下注射D-半乳糖造成脂質(zhì)過氧化物的嚴重積累，從而使機體受到損害。灌胃高劑量的酶解物可顯著降低小鼠肝臟和心臟中MDA含量（P＜0.05），并達到了對照物VE的水平，表明在動物體內(nèi)刺參內(nèi)臟蛋白酶解物是一種優(yōu)良的抗氧化劑。

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Studies on Antioxidant Activities of Protein Hydrolysates from Sea Cucumber Viscera

TAO Hai-ying1，YAN Ming-yan2，*，YIN Li-duan3
（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100，Shandong，China；2.Yantai Institute of Coastal Zone，Research China Academy of Sciences，Yantai 264003，Shandong，China；3Yaitai New Age Health Co.，LTD，Yantai 264006，Shandong，China）

D-galactose subacute aging model of mice was built up for further on studying the antioxidant activities of protein hydrolysates from sea cucumber viscerahydrolysates，the capacity of SOD and GSH-Px and MDA content of mice in liver and heart were detected.Results showed that：the levels of SOD and GSH-Px activity were obviously increased in liver and heart of mice after fed hydrolysates 200 mg/kg·d every day，and MDA content was obviously decreased，suggesting that there was a remarkable antioxidant effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on D-galactose subacute aging model mice.

sea cucumber；viscera；hydrolysates；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.014

2014-11-29

煙臺市科技發(fā)展計劃“刺參內(nèi)臟抗氧化肽制備工藝及活性研究”（2011070）；山東省海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目“海洋活性蛋白及其功能制品的開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化”

陶海英（1977—），男（漢），畜牧師，大專，研究方向：多肽制備。

閆鳴艷，助理研究員，多肽制備。