楊巧虹，萬萌萌，白夢娜，譚睿，宋英，盛榮

（1.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶401147；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031，3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

高效液相色譜法測定糖腎寶顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

楊巧虹1，萬萌萌2，白夢娜2，譚睿2，宋英3，盛榮3

（1.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶401147；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031，3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

目的建立測定糖腎寶顆粒君藥黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30℃。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.01～0.32μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程Y=2 513 055.3X+39 095（r2=1.00）。毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均加樣回收率為101.53%，RSD=2.85%（n=6）。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測定糖腎寶顆粒君藥黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

糖腎寶顆粒；黃芪；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；高效液相色譜法

Yang Qiaohong1，Wan Mengmeng2，Bai Mengna2，Tan Rui2，Song Ying3，Sheng Rong3

（1.Chongqing Quality Testing and Inspection Center for Medical Devices，Chongqing，China 401147；2.Southwest Jiaotong University，

Chengdu，Sichuan，China 610031；3.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu，Sichuan，China 610075）

糖腎寶顆粒為中藥復(fù)方制劑，由黃芪、金櫻子、川芎等中藥組方。黃芪為方中君藥，故選擇其所含毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為控制產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)成分。已報(bào)道的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法有薄層掃描法、超臨界萃取氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析法、氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法、高效液相色譜（HPLC）法及反相高效液相色譜法等。筆者參考2010年版《中國藥典（一部）》及文獻(xiàn)［1-5］，建立了測定糖腎寶顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的HPLC法，旨在為產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高與完善提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

島津LC-6AD高效液相色譜儀；Sartorius BS110十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器。糖腎寶顆粒（批號為20120920，20120921，20120922），缺黃芪陰性樣品（批號為20120923），均由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，供含量測定用，純度98%，批號為MUST-11042915）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［2，6-12］

色譜柱：KromasilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.2%甲酸溶液，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0mL/min；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，色譜圖見圖1。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫表

圖1　高效液相色譜圖

2.2溶液制備

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含16μg的溶液，即得對照品溶液。取本品（批號為20120921），研細(xì)，取5.2 g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）30min，放冷，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺黃芪陰性樣品（批號為20120923），按供試品溶液制備方法同法操作，即得陰性對照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，供試品溶液色譜中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到了基線分離，理論塔板數(shù)不低于3 000，分離度大于1.5，陰性無干擾（見圖1）。

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液（0.2 g/L）0.05，0.20，0.40，0.80，1.60 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，精密吸取各對照品溶液10μL進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測定峰面積。以峰面積（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2 513 055.3 X+39 095，r2=1.00（n=5）。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.01～0.32μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液（0.032 g/L）10μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均峰面積為839 103，RSD=0.95%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10μL，于制備后0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測定含量。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為0.1347mg/g，RSD=1.60%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為20120922），精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為0.136 7 mg/g，RSD=1.35%（n=6），表明方法的重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為20120921），研細(xì)，取2.6 g（0.136 7 mg/g）共6份，精密稱定，分別精密加入對照品溶液（0.038 6 g/L）10mL，按供試品溶液的制備方法制備溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2　毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測定

取3批中試樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10μL，按擬訂的色譜條件測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。2010年版《中國藥典（一部）》“黃芪”項(xiàng)下飲片相關(guān)規(guī)定，黃芪飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量不得少于0.2mg/g，3批樣品的含量測定結(jié)果平均為0.141 9mg/g，該制劑處方中黃芪飲片毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率為57%?？紤]到大生產(chǎn)中含量有一定范圍的波動(dòng)，將毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率下浮10%，故以轉(zhuǎn)移率47%計(jì)算該制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量不得低于0.047mg/g。根據(jù)穩(wěn)定性試驗(yàn)要求，指標(biāo)成分含量的改變應(yīng)小于20%，暫訂糖腎寶顆粒含量以毛蕊異黃酮葡萄糖苷（C22H22O10）計(jì)，不得低于0.037 6mg/g。

表3　樣品含量測定結(jié)果

3　討論

選擇檢測波長時(shí)，取對照品溶液進(jìn)行190～700 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm波長處有最大吸收，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，確定260 nm為檢測波長。色譜柱的選擇考察了APhenomenex C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），Agilent C18柱（150mm×4.6mm，5μm），Kromasil C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），結(jié)果均有較好的保留時(shí)間和峰形，與雜質(zhì)能很好地分離，理論板數(shù)均大于3 000，但最終選擇Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱。對流速0.8～1.2mL/min進(jìn)行考察，結(jié)果流速在1.0mL/min時(shí)分離好，樣品穩(wěn)定。對柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果柱溫在25～35℃時(shí)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量無明顯變化，故選用柱溫為30℃。

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Determ ination of Calycosin G lucoside in Tangshenbao Granules by HPLC

Objective To establish a method for quality control of Tangshenbao Granules.M ethods The chromatography column was Kromasil C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.2%formic acid with the gradient elution at a flow rate of 1 mL/min，at 30℃.Results Calycosin glucoside showed a good linear relationship within the range of 0.01～0.32μg，Y=2 513 055.3X+39 095（r2=1.00），the average recovery rate was 101.53%，RSD=2.85%（n=6）.Conclusion The methods are simple，exact and reproducible，and can be used for the qualitative and quantitative control of Tangshenbao Granules.

Tangshenbao Granules；milkvetch root；calycosin glucoside；HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0085-03

楊巧虹（1977-），女，大學(xué)本科，主要從事醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)工作，（電子信箱）87831702@qq.com；萬萌萌，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化和新制劑研發(fā)，（電子信箱）774235565@qq.com；譚睿，女，博士研究生，教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化和新制劑研發(fā)，本文通訊作者，（電話）028-87600993（電子信箱）tanrui@swjtu.edu.cn。

2015-01-22；

2015-04-22）