【摘 要】依據(jù)基因工程的實(shí)際特點(diǎn)，分別對(duì)獲得目的DNA的反向PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR和錨定PCR等幾個(gè)常用的基因克隆方法進(jìn)行了對(duì)應(yīng)的介紹和分析。

【關(guān)鍵詞】反向PCR;反轉(zhuǎn)錄PCR;錨定PCR;基因克隆;方法

據(jù)實(shí)踐可知，實(shí)施基因工程的程序，首先是要取得目的DNA的片段，這是前期必要的步驟。因此，怎么去圓滿地完成這一過(guò)程，就成為了基因工程中的首要因素。單從目的DNA的提供方式而言，其只有分離天然動(dòng)植物DNA及人造DNA兩種方式。而就獲得目的基因的方法而言，其基本上有PCR、化學(xué)合成、cDNA和設(shè)置基因文庫(kù)的方式進(jìn)行優(yōu)選等幾種類(lèi)型。

1.何謂基因工程的PCR

在一九八五年，美國(guó)相關(guān)公司的數(shù)名專家首先設(shè)置了快速?gòu)?fù)制增加特性DNA片段的工藝技術(shù)，具體的化學(xué)名稱叫做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其英文縮寫(xiě)即為PCR?；蚓酆厦钙鸪跏窃谝痪盼逦迥瓯话l(fā)現(xiàn)的，而富含較高實(shí)用價(jià)值的聚合酶是在七十年代初期才被發(fā)現(xiàn)的。然而，因?yàn)榇司酆厦覆痪哂心透邷匦阅?，其在高溫的情況下就會(huì)發(fā)生較大的性能改變，所以，不適合高溫的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)時(shí)被廣為使用的一種聚合酶，是在一九七六年取自于溫泉水里的一種細(xì)菌。它是具有相當(dāng)耐高溫性能且極為完好的一種酶。初始的PCR概念基本是指基因的修復(fù)和復(fù)制，它具有單一和短暫的性能缺陷。從一九八三年開(kāi)始，PE公司就率先應(yīng)用了新的PCR。

因?yàn)镻CR屬于一類(lèi)體外快速增加指定DNA或其序列的功能系統(tǒng)，所以還可以取名為DNA的體外擴(kuò)增法。在當(dāng)今PCR工藝已經(jīng)是人類(lèi)獲取外部基因的一個(gè)最佳手段，只要掌握了目的DNA的核苷酸排序，人們即能夠擬定出一段引物，采取PCR工藝，在試管內(nèi)設(shè)置反應(yīng)過(guò)程，經(jīng)歷若干小時(shí)以后，即可以把相當(dāng)小量的目的DNA或指定的基因片段增加數(shù)十萬(wàn)倍。甚至達(dá)到百萬(wàn)倍。

2.PCR工藝過(guò)程機(jī)理

由于PCR工藝是一項(xiàng)體外復(fù)制特定基因片段的生物技術(shù)，所以，其與基因分子的體內(nèi)復(fù)制過(guò)程有若干相似的情況，同時(shí)也存在著不少的相異地方。細(xì)胞里基因的復(fù)制過(guò)程是首先把雙鏈DNA分解螺旋變成單鏈DNA。爾后，RNA引物與單鏈DNA模板結(jié)好對(duì)，在有四種核苷酸底物的前提下，基因聚合酶與RNA引物的3端依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的規(guī)則組合成具有互補(bǔ)性的基因鏈。經(jīng)過(guò)一個(gè)復(fù)制過(guò)程后，單個(gè)基因分子變成了雙個(gè)基因分子。PCR就是代表試管里進(jìn)行的基因復(fù)制經(jīng)歷，其余體內(nèi)基因復(fù)制模式相同，都要具備單鏈模板、引物、四種核苷酸底物、基因聚合酶，復(fù)制后達(dá)到相同的效果。其區(qū)別就是PCR所使用的引物是單鏈的基因引物，其聚合酶是屬于耐高溫性能的。在試管中所作的整個(gè)復(fù)制過(guò)程分三個(gè)過(guò)程：第一步是變性過(guò)程，其為PCR反應(yīng)的第一階段，也就是把模板基因放置在九十五攝氏度左右的高溫之中，將雙鏈基因轉(zhuǎn)變成單鏈基因;第二步即為退火過(guò)程，也就是把反應(yīng)溫度下調(diào)到五十?dāng)z氏度左右，促使一隊(duì)引物先后與變性后的兩個(gè)模板實(shí)施配對(duì);第三步為延伸過(guò)程，即把反應(yīng)溫度設(shè)置在聚合酶反應(yīng)的最佳溫度七十二攝氏度，爾后，用目的基因做模板合成新的基因鏈。因?yàn)槠渌镁酆厦傅哪透邷仄焚|(zhì)，在每個(gè)復(fù)制階段完成后，無(wú)需增加任一別的反應(yīng)組分即能夠重新開(kāi)始下一階段的復(fù)制。

3.PCR方法的基因復(fù)制

采用PCR復(fù)制DNA片段系基因工程的一項(xiàng)重要手段。

3.1依托反向PCR復(fù)制目的基因片段

由基因組依托PCR復(fù)制基因片段過(guò)程的重要一環(huán)是引物的擬定，通常能夠依據(jù)業(yè)已公布的基因排列擬定引物，也可以憑借原有的相關(guān)基因序列擬定引物。若要依據(jù)cDNA排列擬定引物增加基因數(shù)目，擬定引物時(shí)，必須顧及到cDNA基因沒(méi)有內(nèi)含子，而gDNA存在內(nèi)含子，擬定引物時(shí)，不能夠置于外顯子的拼接點(diǎn)上。擬定引物時(shí)，一般可以在引物的末端設(shè)置一個(gè)酶切位點(diǎn)，從而促進(jìn)基因片段與載體的連接。

反向PCR系一類(lèi)依托原有系列增加其旁側(cè)序列的模式，憑借此方法，能夠?qū)嵤┤旧w步移。其開(kāi)始的步驟，是把基因組DNA依靠限制性的內(nèi)切酶給予切割開(kāi)來(lái)，莎草用的限制酶必須在原有序列中不存在切點(diǎn)，而后再依托連接酶把酶切片段連接起來(lái)，與此類(lèi)產(chǎn)物中，其含有原來(lái)序列的環(huán)形基因會(huì)得到大幅度增加。由此獲取原來(lái)基因片段的旁側(cè)序列。

3.2 cDNA的制備及cDNA文庫(kù)的建立

cDNA的制備可以采用RT-PCR方法。亦被稱作反轉(zhuǎn)錄PCR。其屬于一類(lèi)酶促進(jìn)制備方法，就是用mDNA做模板，依靠反轉(zhuǎn)錄酶的作用，用四種脫氧核甘三磷酸為反應(yīng)物成分制備DNA，再通過(guò)復(fù)制以后就可得到雙鏈的基因。

3.3錨定PCR過(guò)程及基因的復(fù)制

經(jīng)過(guò)RT-PCR過(guò)程獲取的大規(guī)模雙鏈cDNA以后，欲要精選分離出所需的特定目的基因，若不用cDNA文庫(kù)篩選時(shí)，尚可運(yùn)用錨定PCR的方法將其收獲。此種措施的特點(diǎn)，是憑借原已存在的一中特異性的引物來(lái)實(shí)現(xiàn)，其尤其適合于擴(kuò)增那些緊掌握一段序列形態(tài)的目的基因，比如一端序列已經(jīng)知道，而另一段序列未知的基因片段，能夠依托基因末端轉(zhuǎn)移酶將cDNA第一個(gè)末端添上一端多聚dG尾巴，爾后添加一個(gè)末端屬于多聚dC的特異引物，由此決定了擴(kuò)增的特性。錨定PCR是研究遺傳學(xué)及醫(yī)學(xué)的有效方法。

小結(jié)

通過(guò)上述介紹和分析，我們基本掌握了獲取目的基因的來(lái)源和幾種相當(dāng)實(shí)用的基因克隆方法，這幾種很常用的方法，它們都有各自的特性和優(yōu)點(diǎn)，我們?cè)趯?shí)際基因工程研究中，還要不斷的總結(jié)、完善并加以創(chuàng)新，促使其能夠更好地為我們?nèi)祟?lèi)的遺傳、醫(yī)學(xué)等相關(guān)行業(yè)服務(wù)。

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【作者簡(jiǎn)介】

于麗麗（1981.12-），籍貫：吉林省梨樹(shù)縣;單位：公主嶺實(shí)驗(yàn)中學(xué)。

（作者單位：公主嶺實(shí)驗(yàn)中學(xué)）