張志紅,于一尊,黃江麗,張國(guó)華,譚胤靜,鄭國(guó)華,涂祖新,陳宇煒
1.江西省科學(xué)院生物資源研究所,江西 南昌 330096;2.江西省科學(xué)院微生物研究所,江西 南昌 330096;3.中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所,江蘇 南京 210008
隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人類活動(dòng)導(dǎo)致湖泊污染己成為嚴(yán)重的環(huán)境問題,其中湖泊富營(yíng)養(yǎng)化是最主要表現(xiàn)(王國(guó)惠,1998)。據(jù)報(bào)道,我國(guó)有63.3%的湖泊已經(jīng)達(dá)到富營(yíng)養(yǎng)化水平,氮、磷是公認(rèn)的重要影響因子。在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中,氨化細(xì)菌(Ammonifying bacteria)將水中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮,其中大部分轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的氨氣直接進(jìn)入大氣,反硝化細(xì)菌(Denitrifying bacteria)將無機(jī)氮鹽(NO3--N及NO2--N)還原為N2O及N2,釋放到大氣中,降低了水體中的氮負(fù)荷,對(duì)于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的凈化具有重要意義(GILLIAM,1994)。大腸桿菌(Escherichia coli)是評(píng)價(jià)水質(zhì)好壞的一個(gè)重要衛(wèi)生指標(biāo),是反映水體被生活污水污染重要的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。
鄱陽(yáng)湖是我國(guó)最大的淡水湖,擁有豐富的水資源和生物資源,具有蓄洪、航運(yùn)、灌溉、水產(chǎn)養(yǎng)殖和旅游等多方面功能。鄱陽(yáng)湖區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)與環(huán)境保護(hù)相互協(xié)調(diào)、共同發(fā)展,是湖區(qū)發(fā)展戰(zhàn)略的重要內(nèi)容,水環(huán)境保護(hù)則是鄱陽(yáng)湖區(qū)環(huán)境保護(hù)的基本內(nèi)容和主要目標(biāo)。近年來,環(huán)鄱陽(yáng)湖地區(qū)大規(guī)模發(fā)展?jié)O業(yè)養(yǎng)殖,圍湖區(qū)域水產(chǎn)養(yǎng)殖面積超過 18.67×104hm2,水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá) 5.8×104t,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展加速了湖泊水體的富營(yíng)養(yǎng)化。另外,農(nóng)村面源污染也十分嚴(yán)重,2012年時(shí),全流域化肥施肥量4.27×107t,農(nóng)藥施用量為1×106t,大量未被利用的化肥和農(nóng)藥殘留物直接或者間接進(jìn)入鄱陽(yáng)湖水體,導(dǎo)致鄱陽(yáng)湖水質(zhì)下降(王圣瑞等,2013)。鄱陽(yáng)湖污染物來源以及污染變化與洞庭湖有許多相似之處,但是鄱陽(yáng)湖也有自己獨(dú)特性(李有志等,2011)。鄱陽(yáng)湖是一個(gè)季節(jié)性漲水湖泊,具有“高水是湖,低水似河”獨(dú)特的自然地理景觀。每年汛期,五河洪水入湖,湖水漫灘,洪水一片;冬春季節(jié),湖水落槽,灘地顯露,水面縮小,洪、枯水位面積相差10多倍,水量變化也將對(duì)湖區(qū)微生物生理群和環(huán)境因子產(chǎn)生巨大影響。本文以氮循環(huán)微生物和大腸桿菌群等生理菌群為研究對(duì)象,分析這些菌群時(shí)空分布特征以及與氮、磷等富營(yíng)養(yǎng)化指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系,以期為環(huán)境監(jiān)測(cè)和保護(hù)鄱陽(yáng)湖水質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。
樣品采集時(shí)間選擇鄱陽(yáng)湖豐水期和枯水期兩個(gè)時(shí)間段,豐水期采樣時(shí)間為2012年7月份,枯水期采樣時(shí)間為2013年1月份,樣品采集點(diǎn)分布見圖 1。水樣基礎(chǔ)數(shù)據(jù)由中國(guó)科學(xué)院鄱陽(yáng)湖湖泊濕地觀測(cè)研究站提供。
蛋白胨培養(yǎng)基(檢測(cè)氨化細(xì)菌):蛋白胨5.0 g,磷酸氫二鉀0.5 g,磷酸二氫鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.2。
改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基 A(檢測(cè)亞硝化細(xì)菌):硫酸銨2.0 g,磷酸氫二鉀0.75 g,磷酸二氫鈉0.25 g,硫酸錳0.01 g,硫酸鎂0.03 g,碳酸鈣5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.2。
改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基B(檢測(cè)硝化細(xì)菌):亞硝酸鈉1.0g,磷酸氫二鉀0.75 g,磷酸二氫鈉0.25 g,硫酸錳0.01 g,硫酸鎂0.03 g,碳酸鈉1.0 g,碳酸鈣1.0 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.2。
反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基:硝酸鉀2.0 g,硫酸鎂0.2 g,磷酸氫二鉀1.0 g,磷酸二氫鉀1.0 g,檸檬酸鈉5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.2。
乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(檢測(cè)大腸桿菌):蛋白胨0 g,豬膽鹽5.0 g,乳糖10 g,溴甲酚紫0.01 g,pH(7.4±0.2)。
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(檢測(cè)異養(yǎng)細(xì)菌):牛肉膏3.0 g,蛋白胨10 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0~7.5。
解磷細(xì)菌培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,硫酸銨0.5 g,氯化鈉0.3 g,氯化鉀0.3 g,硫酸鎂0.3 g,硫酸亞鐵0.03 g,硫酸錳0.03 g,碳酸鈣5.0 g,卵磷脂0.5 g,磷酸三鈣2.0 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0~7.5。
大腸桿菌、氮循環(huán)微生物(氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌)采用 MPN方法,大腸桿菌測(cè)定1、10、100 mL 3個(gè)濃度水平,氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌測(cè)定0.1、1、10 mL 3個(gè)濃度水平,每個(gè)濃度重復(fù)3次,五種生理菌群陽(yáng)性檢測(cè)和觀察參考相關(guān)文獻(xiàn)(陳紹銘和鄭福壽,1985)。
異養(yǎng)細(xì)菌和解磷細(xì)菌計(jì)數(shù)采用稀釋平板涂布法,水樣連續(xù)稀釋100倍后取0.1 mL涂平板;底泥樣品稱取10 g,加入裝有90 mL無菌水錐形瓶中,充分震蕩5 min稍靜置后取上清液連續(xù)稀釋100倍取0.1 mL涂平板。
所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003和SASV 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
2012年7 月份鄱陽(yáng)湖豐水期水樣結(jié)果見表1。大腸桿菌平均數(shù)量為109.82 MPN·100mL-1,其中有33個(gè)樣品中大腸桿菌小于20 MPN·100 mL-1,達(dá)到國(guó)家一類水標(biāo)準(zhǔn),占總樣品數(shù)44.0%。水質(zhì)最差、大腸桿菌為300 MPN·100mL-1有23個(gè),占總樣品數(shù)30.67%,具體分析這些采樣點(diǎn)分布區(qū)域,多是距離居民生活區(qū)較近,與人類生活、漁業(yè)和畜禽養(yǎng)殖等密切相關(guān)。測(cè)定氮循環(huán)微生物,硝化細(xì)菌數(shù)量最高,所有樣品在檢測(cè)濃度內(nèi)全部變色,數(shù)量超過3000 MPN·100mL-1。氨化細(xì)菌平均為 975.11 MPN·100mL-1,亞硝化細(xì)菌(Nitrosobacteria)和反硝化細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較低,平均為 45.68和 127.51 MPN·100 mL-1。不同湖泊流域中氮循環(huán)生理菌群數(shù)量不同,閆韞(2008)研究布吉河發(fā)現(xiàn)氨化菌數(shù)量最多,高達(dá) 8~12個(gè)數(shù)量級(jí),亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌數(shù)量極少,認(rèn)為氮循環(huán)菌群存在嚴(yán)重的數(shù)量不均衡現(xiàn)象。綜合分析不同采樣點(diǎn)氮循環(huán)菌群和大腸桿菌數(shù)量,再結(jié)合總氮、總磷測(cè)定結(jié)果,認(rèn)為都昌周溪鎮(zhèn)、西源鄉(xiāng)、夢(mèng)溪鄉(xiāng)獅山鄉(xiāng)等一帶水域以及鄱陽(yáng)湖湖區(qū)中心是微生物數(shù)量最少的區(qū)域,同時(shí)氮、磷等也較低,水質(zhì)好,屬于輕度富營(yíng)養(yǎng)化;五河入湖口以及臨近居民生活區(qū)域的采樣點(diǎn),微生物數(shù)量和氮、磷含量最高,出現(xiàn)不同程度的富營(yíng)養(yǎng)化。鄱陽(yáng)湖營(yíng)養(yǎng)鹽濃度較高,2009─2011年年均總氮濃度為1.719 mg·L-1,總磷濃度為 0.090 mg·L-1,且有逐年增加的趨勢(shì),按照營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)劃分標(biāo)準(zhǔn),鄱陽(yáng)湖某些區(qū)域處于明顯富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)(WU等,2013)。分析水體中異養(yǎng)細(xì)菌,平均數(shù)值為 149.48×103CFU·mL-1,樣品之間差異較大。測(cè)定水體中解磷細(xì)菌和有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌,少數(shù)樣品數(shù)量在20~80·mL-1,多數(shù)樣品中沒有檢測(cè)到解磷細(xì)菌,水體中也沒有富集到降解甲胺磷等農(nóng)藥的微生物。觀察分離所得異養(yǎng)細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)水體中以革蘭氏陰性為主,產(chǎn)色素菌數(shù)量較高,占總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量10%左右。初步鑒定,細(xì)菌中假單胞菌(Pseudomonas)較多,其次為芽孢桿菌(Bacillus)和腸桿菌(Enterobacteriaceae),還有微球菌屬(Micrococcus)、色桿菌屬(Chromobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和黃單孢菌屬(Xanthomonas)等細(xì)菌,分析結(jié)果與多數(shù)湖泊異養(yǎng)細(xì)菌類型相似(吳根福等,1999)。
表1 豐水期部分取樣點(diǎn)水體中五種生理菌群和異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量Table 1 Amount of different bacteria in Poyang lake during wet seasons
將鄱陽(yáng)湖水質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與大腸桿菌和氮循環(huán)微生物進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明(見表 2),溶氧量(DO)與亞硝化細(xì)菌成極顯著正相關(guān),與亞硝化細(xì)菌是好氧菌有關(guān)。電導(dǎo)率與氨化細(xì)菌成極顯著正相關(guān),而與亞硝化細(xì)菌則成顯著負(fù)相關(guān),可能這兩種菌群與某類物質(zhì)增加或減少密切有關(guān)??偟浚═N)與樣品中大腸桿菌、氨化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌均成極顯著正相關(guān),總氮含量高,引起大量氮循環(huán)微生物繁殖,利于污染物降解。亞硝酸鹽(NO2-)、硝酸鹽(NO3-)和銨鹽(NH4+)含量與氮循環(huán)微生物沒有顯著性相關(guān)關(guān)系,此結(jié)果在一定程度上表明,水體中氮循環(huán)微生物數(shù)量高低與氮總量有關(guān),是不同氮的綜合效應(yīng)。吳楚等(2000)研究九山湖表明,硝化細(xì)菌與銨鹽存在顯著的正相關(guān)、反硝化細(xì)菌與亞硝酸鹽存在顯著正相關(guān),王國(guó)惠(1996)認(rèn)為湖區(qū)中銨鹽(NH4+)數(shù)量與亞硝化細(xì)菌不存在相關(guān)性有3個(gè)原因:(1)藻類與亞硝化細(xì)菌對(duì)氨氮競(jìng)爭(zhēng);(2)硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌屬于自養(yǎng)菌,過多的有機(jī)質(zhì)會(huì)阻礙它們的發(fā)育;(3)氨氮的瞬時(shí)濃度可能較高,當(dāng)取樣次數(shù)有限時(shí),存在誤差,而吳根福等(1999)研究表明自養(yǎng)型細(xì)菌(如硝化細(xì)菌)在水質(zhì)較好的水體中分布廣泛,異養(yǎng)型微生物如氨化細(xì)菌等在富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重的湖中密度較大。分析還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌均呈極顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)R分別為0.518、0.442和0.332,結(jié)果略)。不同生理菌群數(shù)量高低,除了與氮、磷等含量有關(guān),溫度、pH、水流速度等也是不可忽視的影響因素。
表2 鄱陽(yáng)湖豐水期各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of different indexes in Poyang lake during wet seasons
表3 部分鄱陽(yáng)湖底泥樣品中不同微生物數(shù)量Table 3 Amount of different bacteria in Poyang lake sediments
比較底泥中異養(yǎng)細(xì)菌、芽孢桿菌和解磷細(xì)菌(Phosphate-solubilizing bacteria)數(shù)量(見表3),芽孢桿菌占全部異養(yǎng)細(xì)菌總量的30%左右,解磷細(xì)菌數(shù)量低,僅占 5%左右。不同解磷細(xì)菌解磷效果差異較大,有些解磷細(xì)菌初次篩選效果明顯,解磷圈與菌落之比達(dá)到3.5以上,純化后多數(shù)解磷細(xì)菌的解磷圈消失,說明解磷效果容易受外界影響。將3類細(xì)菌與水體中總氮、總磷和磷酸鹽(PO43-)進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析(見表 4),底泥中的芽孢桿菌與異養(yǎng)細(xì)菌之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,解磷細(xì)菌和水體中總氮和總磷之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,而與磷酸鹽之間卻呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,這個(gè)結(jié)果是否表明底泥中的解磷細(xì)菌通過降解作用釋放出更多內(nèi)源磷,從而提高了水體中磷酸鹽數(shù)量?蘇爭(zhēng)光等(2014)在研究分析云南撫仙湖內(nèi)源磷來源時(shí)提出沉積物中解磷細(xì)菌數(shù)量決定撫仙湖沉積物磷釋放強(qiáng)度。
表4 豐水期底泥中微生物與水體中總氮、總磷和磷酸鹽相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of total P, N, PO43- and bacteria in Poyang lake sediments
表5 鄱陽(yáng)湖豐水期和枯水期水體中四種生理菌群數(shù)量的比較Table 5 Compare of bacteria amounts in Poyang lake between wet and dry seasons
比較豐水期和枯水期微生物差異(見表5),大腸桿菌、氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌數(shù)量變化一致,7月份豐水期取樣明顯高于冬季枯水期,分別比冬季高出21.5、21.4和11.5倍。一方面隨著夏季的到來,不同有機(jī)物隨雨水進(jìn)入湖泊,為微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供豐富的底物;另一方面夏季溫度升高,加速了微生物的繁衍,從而增加了微生物的生物量(WU等,2014)。說明溫度是影響大腸桿菌、氨化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌數(shù)量和分布的主要因素。吳根福等(1999)研究杭州西湖水體中氨化細(xì)菌在夏季較少,冬季反而較多。反硝化細(xì)菌具有還原硝酸鹽成亞硝酸鹽并進(jìn)一步還原生成氮?dú)庾饔?,解除亞硝酸鹽的危害,反硝化細(xì)菌數(shù)量對(duì)于降低鄱陽(yáng)湖富營(yíng)養(yǎng)化問題具有重要意義。本研究中反硝化細(xì)菌變化同其它3類微生物相反,冬季反比夏季高出 5.3倍。分析原因有兩個(gè)可能:(1)鄱陽(yáng)湖水體中浮游植物的光合作用對(duì)于反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)具有抑制作用,而夏季正值鄱陽(yáng)湖水體中浮游植物生長(zhǎng)的旺盛期(WU等,2014),通過光合作用產(chǎn)生大量的氧,不利于反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)。冬季枯水期隨著浮游植物的大量衰亡,湖中氧氣的減少,反硝化細(xì)菌的數(shù)量則呈升高的趨勢(shì);(2)當(dāng)鄱陽(yáng)湖處于枯水期,硝酸鹽濃度相對(duì)提高,刺激了反硝化細(xì)菌大量繁殖。研究結(jié)果同白雪等(2012)分析黑龍江省北部五大連池反硝化細(xì)菌與溫度變化關(guān)系一致。王國(guó)惠(1996)研究認(rèn)為反硝化細(xì)菌與溫度和藻類數(shù)量呈顯著的正相關(guān),由于溫度很高時(shí),異養(yǎng)菌大量繁殖致使有機(jī)物得以降解,無機(jī)物大量釋放,致使藻類濃度升高,但環(huán)境中氧的濃度也大幅度下降,有利于反硝化細(xì)菌的繁殖。硝化作用發(fā)生在好氧條件下,反硝化作用發(fā)生在厭氧或兼性厭氧環(huán)境,隨著研究的不斷深入,多種好氧反硝化微生物陸續(xù)從不同環(huán)境中篩選出來(楊小龍等,2011;韓永和等,2013)。出現(xiàn)不同研究結(jié)果,需要進(jìn)一步分析氮循環(huán)相關(guān)微生物自身功能的多樣性,以及湖泊水域環(huán)境條件,如水生植物覆蓋對(duì)氮循環(huán)微生物影響最大(王國(guó)祥等,1998)。
豐水期樣品中5種生理菌群數(shù)量差異較大,四種參與氮循環(huán)的微生物中,硝化細(xì)菌數(shù)量最高,氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較低;有 44%水樣品中大腸桿菌數(shù)量低于 20 MPN·100mL-1,達(dá)到國(guó)家一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn),鄱陽(yáng)湖水質(zhì)總體保持良好。多數(shù)水樣品中沒有檢測(cè)到解磷細(xì)菌,底泥中存在大量解磷細(xì)菌,占異養(yǎng)細(xì)菌 5%左右。比較豐水期和枯水期樣品,大腸桿菌、氨化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌3種菌群由于溫度原因,冬季枯水期明顯低于夏季豐水期,反硝化細(xì)菌枯水期明顯高于豐水期,溫度和溶解氧是重要影響因素??偟c樣品中大腸桿菌、氨化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系,大腸桿菌與氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌也呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系。大腸桿菌、氨化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌可以作為鄱陽(yáng)湖夏季總氮污染的主要指標(biāo)微生物。
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