汪輝煌，崔國庭

（1.黃山職業(yè)技術學院，安徽 黃山245000；2.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽471003）

潰瘍菌是引起獼猴桃潰瘍病的主要病原菌，由潰瘍菌引發(fā)的潰瘍病成為獼猴桃的主要病害之一。病害發(fā)生時，獼猴桃樹整株枯死，造成果園毀滅，顆粒無收，產(chǎn)量與品質嚴重受損[1]。含銅殺菌劑、鏈霉素等最初作為抑制潰瘍菌有效的藥物，隨著抗銅離子、抗鏈霉素菌株的出現(xiàn)，這些殺菌劑抗菌效果不斷的減弱[2]。尋找到新的有效抑制潰瘍菌的殺菌劑成為目前獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迫切需求。

黃連、五味子是我國的傳統(tǒng)中藥，該藥安全性高、副作用小、成本低、抗菌范圍廣、且具有抗病毒作用，在我國被廣泛應用[3-4]。近年來，大量的研究顯示，黃連、五味子對多種革蘭氏陽性和陰性菌均有抑制作用[5-7]。目前，有關黃連、五味子醇提物對于獼猴桃潰瘍菌的抑制作用與機理的研究鮮見報道，本文就這方面的進行了研究。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

供試菌種：獼猴桃潰瘍菌；

黃連、丁香、五味子、蒼術、沉香、益智、花椒、虎杖、牡丹皮、高良姜、艾葉。

試劑：無水乙醇（分析純）。

1.2 主要儀器：

旋轉蒸發(fā)儀，真空凍干機，恒溫干燥箱，超聲波清洗器，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，超凈工作臺，冰箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃連、五味子等中藥提取物的制備

黃連、五味子等中藥經(jīng)50℃干燥后粉碎，過60目篩，取100g，用70%乙醇以料液比為1：10在50℃條件下水浴浸提8h，浸提兩次，合并提取液、用旋轉蒸發(fā)器減壓濃縮至膏狀、真空凍干機中干燥、粉碎即得中藥乙醇粗提取物，取4mg溶于1mL70%乙醇中，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基及潰瘍菌懸液的制備[8]

KB培養(yǎng)基的制備：1L水中加入20g蛋白胨、1.5g硫酸鎂、1.5g磷酸氫二鉀、17g瓊脂，加熱溶解，121℃高壓滅菌30min，趁熱在超凈工作臺上倒入無菌平皿，備用。

菌懸液的制備：挑選長勢較好的潰瘍菌接入不含瓊脂的KB液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)16-24h，活化潰瘍菌繁殖，當菌液由透明變黃色混濁時終止培養(yǎng)，低溫保藏備用。

制備抑菌濾紙片：取普通的定量濾紙，使用打孔器做成直徑為6mm圓片，置于潔凈干燥燒杯內(nèi)干熱滅菌（120℃，2h）后，分別浸于黃連、五味子、丁香、蒼術、沉香、益智、花椒、虎杖、牡丹皮、高良姜、艾葉等不同濃度的藥液中24h，取出晾干備用。

抑菌實驗(瓊脂平板擴散法)：取平皿，倒入培養(yǎng)基、冷卻后，在培養(yǎng)基上均勻涂布一層稀釋的試驗菌，試驗菌用量以對照平皿表面菌生長能呈半密集菌落為定。然后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中5min，使其表面干燥，將抑菌濾紙片按標號依次貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使接觸良好。倒置培養(yǎng)（30℃）12h后，取出平皿，觀察抑菌圈大小并測定其直徑。

1.3.3 中藥的抑菌作用

取一定質量的黃連、丁香、五味子、蒼術、沉香、益智、花椒、虎杖、牡丹皮、高良姜、艾葉提取物，加乙醇配制成相同濃度的溶液，采用瓊脂平板擴散法測定其抑菌作用，以抑菌環(huán)直徑（cm）表示：抑菌環(huán)直徑=抑菌圈直徑（cm）-濾紙片直徑（cm）。

1.3.4 最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）[9]

最低抑菌濃度是指在體外能夠抑制細菌生長的最低濃度。采用肉湯培養(yǎng)基測定方法。稱取少量干燥后的黃連、五味子提取物，用乙醇配制成一定濃度為的溶液，加入96孔板，并逐倍稀釋，加入菌懸液，使菌懸液最終OD值達到0.030左右，黃連、五味子提取物最終濃度達到0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024mg/mL。 并設空白與對照組，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h，檢測。實驗重復3次。

1.3.5 黃連、五味子提取物對潰瘍菌生長抑制[10-11]

活化潰瘍菌，將其接種于肉湯培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12h，加入黃連、五味子提取物28℃條件下，過一段時間取培養(yǎng)液進行平板活菌計數(shù)，與未加黃連、五味子提取物的菌液對比，實驗重復3次。

1.3.6 潰瘍菌培養(yǎng)液中可溶性總糖的測定[12]

活化潰瘍菌，28℃，100r/min振蕩培養(yǎng)12h，取適量菌液，加入黃連、五味子提取物，使其最終濃度達到64μg/mL， 分別于28℃，100r/min培養(yǎng)0h、1h、2h、4h、6h、8h后取出，4000r/min離心20min， 取上清液200μL，加水稀釋至1.0mL，加入蒽酮試劑4.0mL，冷卻5min，沸水浴10min，室溫冷卻10min，于620nm處測定OD值，以葡萄糖標準溶液作標準曲線，以無菌水代替黃連、五味子提取物作為空白對照，實驗重復3次。

1.3.7 提取物對菌體磷代謝的影響[12]

根據(jù)翟培等的方法[13]，將活化的獼猴桃潰瘍菌轉接到營養(yǎng)肉湯中，恒溫條件下培養(yǎng)（28℃，12h），然后以4000r/min離心20min，棄上清液，菌體用pH 7.4的磷酸緩沖液（0.1mol/L）稀釋為106CFU/mL的菌液；取菌液和葡萄糖溶液各0.5mL置于離心管內(nèi)，加入磷標準溶液，再分別加入黃連、五味子提取液，分別在0、1、2、4、6、8、10h吸取懸浮液0.1mL，用三氯乙酸-硫酸亞鐵和鉬酸銨處理后，使用酶標儀在630nm處測定處理液的OD值。同時做空白對照。重復實驗3次。

2 結果與分析

2.1 中藥對潰瘍菌的抑制作用

11種中藥對潰瘍菌的抑制作用見圖1。

圖1 中藥對于潰瘍菌的抑制作用

由圖1可以看出，在體外抑菌試驗中，除沉香、益智、高良姜對潰瘍菌沒有抑制作用外，其余的中藥都有抑制作用，中藥的對潰瘍菌抑制作用大小是黃連＞五味子＞丁香＞艾葉＞花椒＞虎杖＞蒼術＞牡丹皮，其中以黃連效果最好，五味子次之。

2.2 最低抑菌濃度（MIC/MBC）

選擇對潰瘍菌抑菌效果較好黃連和五味子進行最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定，實驗結果見表1。

表1 MIC/MBC

由表1可以看出，黃連、五味子的MIC和MBC結果相同，與上個實驗結果所示顯示的黃連抑菌環(huán)直徑大于五味子的抑菌環(huán)直徑有差異，這種差異可能是由實驗方法的不同所引起，但兩種方法所顯示黃連、五味子對于潰瘍菌抑制作用相近。

2.3 潰瘍菌的生長抑制曲線

黃連、五味子提取物對潰瘍菌的生長抑制作用見圖2。

圖2 生長抑制曲線

從圖2可以看出，黃連、五味子提取物對潰瘍菌的抑制、殺死作用與其濃度有關。當黃連、五味子提取物濃度為64μg/mL時，在2h內(nèi)能夠殺死潰瘍菌；當加入的濃度為8μg/mL，在一定時間內(nèi)（4h）抑制潰瘍菌的生長，但不能滅菌，隨著時間的延長，細菌開始迅速的生長繁殖。24h后（圖上未顯示），對照組的cfu達到5.67×108；加入8μg/mL黃連的cfu達到3.67×107，加入8μg/mL五味子的cfu達到2.9×107。結果顯示，加入黃連、五味子提取物濃度低于最低抑菌濃度時，雖然不能殺死潰瘍菌，但是能夠抑制潰瘍菌的生長，延緩其細菌數(shù)目的增加。

2.4 菌液中的可溶性總糖

糖類是細菌重要的碳源及能源儲備物質。當細菌生理狀態(tài)正常時，能夠吸收利用外源的糖類。細胞膜是細菌的保護屏障，正常狀態(tài)下具有流動性和半透性等功能，當細胞膜遭到破壞后，其固有的功能將會喪失，導致細菌細胞膜的流動性降低和通透性增大，從而喪失對細菌菌體的保護作用，菌體內(nèi)容物（包括糖類）發(fā)生外泄。因此，細菌細胞膜通透性的變化可由菌液中糖含量的變化情況來反映[14-16]。時間的延長逐漸上升，然而，對照組均顯示了培養(yǎng)液中可溶性糖濃度沒有太多變化。這個實驗結果表明黃連、五味子提取物能改變潰瘍菌細胞膜的通透性，使的菌體內(nèi)的糖類物質逐漸滲漏到菌體外，造成了菌液中糖濃度的升高。

2.5 提取物對菌體磷代謝的影響

磷是細菌需要的微量元素，是核酸、磷脂及糖代謝的中間產(chǎn)物的重要組成成分，且在細胞能量代謝中起重要的作用[16]。細菌利用葡萄糖經(jīng)過一系列磷酸化反應,為生長繁殖提供所需能量，因此，通過檢測細菌代謝活動中磷的消耗狀況可反映細菌菌體的整體代謝功能和生長狀態(tài)。從圖4可以看出，當潰瘍菌與黃連、五味子作用后，與對照相比較, 磷消耗量均隨著作用時間的延長而逐漸降低，表明潰瘍菌的磷代謝受到影響，證明黃連、五味子不僅可以破壞細胞膜，還可以影響細胞中的磷代謝。

圖4 黃連、五味子處理后潰瘍菌的磷代謝變化

抗菌藥物對于細菌的抑制、殺死的主要靶標有3個方面：一是對于細胞膜的破壞，干擾細胞膜的合成；二是對蛋白質合成的干擾；三是對遺傳物質的復制和修復的干擾破壞[18]。從本次實驗研究表明，黃連、五味子提取物能夠抑制、殺死潰瘍菌，其抑菌、殺菌的效果與黃連、五味子提取物的劑量有直接的關系。

3 結 論

圖3 黃連、五味子提取物對菌液中糖含量的影響

如圖3所示，當潰瘍菌與64μg/mL的黃連、五味子提取物作用后，菌液中可溶性糖的濃度隨著作用

研究結果表明，黃連、五味子提取物對潰瘍菌具有抑制、致死作用，且隨著濃度的增加，抑菌、殺菌效果也增加。這預示中藥乙醇提取物不僅在食品保藏方面有應用價值，而且在獼猴桃潰瘍病的防治方面也具有開發(fā)利用價值。黃連、五味子提取物的抑菌、殺菌效果還與所用的劑量有關，其MIC為0.016mg/mL，MBC為0.064mg/mL。研究結果還表明，黃連、五味子提取物濃度高于0.064mg/mL，對潰瘍菌的細胞壁完整性造成破壞，引起潰瘍菌細胞膜通透性發(fā)生變化，造成內(nèi)部物質如糖類等物質外泄；還可以干擾潰瘍菌的磷代謝過程，造成細菌死亡，從而達到抑菌、殺菌目的。提取物的具體作用靶點及作用機制，尚需進一步研究和探討。

長期使用化學農(nóng)藥引起的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，使得尋找低毒、高效、低殘留、低污染的“綠色農(nóng)藥”成為了迫切的任務。植物源農(nóng)藥來源廣泛、具有低毒、低殘留、對非靶標生物及環(huán)境的安全性，不易產(chǎn)生抗藥性，能夠降低或避免化學農(nóng)藥帶來的“農(nóng)藥公害”等優(yōu)點。植物源殺菌劑的研究正符合現(xiàn)代人們對農(nóng)藥的要求及其未來農(nóng)藥的發(fā)展方向，黃連、五味子為開發(fā)天然植物源殺菌劑增加了新的選擇。

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