葉 妮 陳衛(wèi)昌

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院特需病區(qū)1(215006) 消化內(nèi)科2

腫瘤細(xì)胞具有逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷的免疫逃逸能力，免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子表達(dá)異常不僅可抑制宿主的抗腫瘤免疫應(yīng)答，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，還可對(duì)腫瘤疫苗的抗腫瘤免疫作用產(chǎn)生干擾。Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)和髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)被認(rèn)為是最為關(guān)鍵的參與腫瘤免疫逃逸機(jī)制的細(xì)胞亞群，研究表明CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞可在腫瘤微環(huán)境中聚集，抑制腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)，從而阻礙抗腫瘤免疫應(yīng)答［1］，而MDSCs可通過(guò)產(chǎn)生精氨酸酶1(ARG1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧簇(ROS)以及消耗胱氨酸和半胱氨酸等途徑抑制T細(xì)胞激活和T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫［2-3］。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌患者和健康對(duì)照者的外周血Treg細(xì)胞、MDSCs比率，并分析兩者與胃癌臨床病理特征的關(guān)系以及兩者間的相關(guān)性，初步探討Treg細(xì)胞和MDSCs在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集2011年10月至2012年6月于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的胃癌患者77例，入組患者胃癌診斷均經(jīng)胃鏡活檢或手術(shù)病理證實(shí)，其中男54例，女23例，年齡24～84歲，平均(62.10±12.83)歲。54例行手術(shù)治療者術(shù)前均未接受過(guò)放化療，術(shù)后病理均為胃腺癌，根據(jù)UICC/AJCC第7版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［4］，早期胃癌(ⅠA、ⅠB 期)10例，中晚期胃癌(ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB、Ⅳ期)44例。同期20例健康體檢者作為正常對(duì)照組，入組者排除心、肝、肺、腎等重要臟器疾病，肝腎功能正常，無(wú)腫瘤家族史，其中男10例，女10例，年齡58～79歲，平均(65.42±18.74)歲。兩組間性別構(gòu)成和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

二、主要試劑和儀器

熒光標(biāo)記抗體 FITC-抗人 CD4、APC-抗人CD25、PE-抗人 Foxp3、PE-大鼠 IgG2a 同型對(duì)照和固定破膜劑、破膜緩沖液(eBioscience，Inc.)，熒光標(biāo)記抗體 FITC-抗人 CD14、PE/Cy5-抗人 HLA-DR 和紅細(xì)胞裂解液(BioLegend，Inc.)，CytomicsTMFC 500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Inc.)。

三、方法

1.樣本采集:受試者于清晨抽取空腹外周血3 mL(手術(shù)患者于術(shù)前1 d采血)，EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離純化外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。

2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞:將新鮮分離的PBMC配制成1×106個(gè)/100 μL的細(xì)胞懸液，加入FITC-抗人CD4和APC-抗人CD25各5 μL，4 ℃避光孵育 30 min，PBS 洗滌、棄上清;加入固定破膜劑1 mL混勻，常溫避光孵育45 min，加入破膜緩沖液 2 mL，離心、棄上清;加入 PE-抗人Foxp3或PE-大鼠IgG2a同型對(duì)照5 μL混勻，4℃避光孵育45 min，加入破膜緩沖液2 mL，離心、棄上清;加入PBS 300 μL，充分混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比率。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDSCs:取25 μL EDTA抗凝外周血，加入 FITC-抗人 CD14和 PE/Cy5-抗人HLA-DR 各0.25 μL，4 ℃ 避光孵育 30 min，加入紅細(xì)胞裂解液100 μL，37℃溫箱孵育10 min溶血，PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+HLA-DR-/lowMDSCs比率。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、外周血Treg細(xì)胞、MDSCs比率

對(duì)77例胃癌患者和20例健康對(duì)照者外周血標(biāo)本的流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，胃癌組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占比率、MDSCs在單核細(xì)胞中所占比率均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Treg細(xì)胞:4.72%±1.01%對(duì)1.57%±0.99%，P＜0.01;MDSCs:21.72% ±10.12%對(duì)2.90% ±1.80%，P＜0.01)(圖1、圖2)。

圖1 各組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞流式圖

二、胃癌患者外周血Treg細(xì)胞、MDSCs比率與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

對(duì)54例手術(shù)胃癌患者的統(tǒng)計(jì)分析顯示，患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比率與胃癌臨床分期、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05);而外周血MDSCs占單核細(xì)胞的比率僅與胃癌臨床分期相關(guān)，中晚期胃癌患者M(jìn)DSCs比率顯著高于早期胃癌患者(P＜0.05)，與胃癌浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)(表1)。

三、胃癌患者外周血Treg細(xì)胞與MDSCs比率的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，胃癌組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率與MDSCs比率呈顯著正相關(guān)(rs=0.681，P＜0.01)。

討 論

腫瘤具有潛在免疫原性，腫瘤患者體內(nèi)存在腫瘤特異性免疫應(yīng)答，然而腫瘤環(huán)境中的免疫抑制性網(wǎng)絡(luò)可使腫瘤逃避此種免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并減弱免疫療法的療效［5］。近年，研究者開(kāi)始關(guān)注腫瘤相關(guān)抑制性細(xì)胞，并相繼發(fā)現(xiàn)了多種免疫抑制性細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性樹(shù)突細(xì)胞(DCreg)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、Treg細(xì)胞、MDSCs等，這些細(xì)胞參與腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受、免疫抑制等過(guò)程，抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展［6-8］。

表1 胃癌患者外周血Treg細(xì)胞、MDSCs比率與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(，%)

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中扮演重要角色，其在各種惡性腫瘤組織中呈過(guò)表達(dá)已逐漸得到證實(shí)。Treg細(xì)胞對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫的抑制作用呈細(xì)胞接觸依賴(lài)性，研究顯示Treg細(xì)胞可表達(dá)顆粒酶B和穿孔素，在腫瘤環(huán)境中，其活化可殺傷效應(yīng)T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和DC［9-10］。此外，Treg細(xì)胞還可高表達(dá)細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)，下調(diào)DC表面共刺激分子CD80/CD86表達(dá)，減少T細(xì)胞活化［11］。本研究流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占比率顯著高于健康對(duì)照者，并與胃癌臨床分期、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

MDSCs是一類(lèi)未成熟的異質(zhì)性髓系細(xì)胞群體，包括髓系前體細(xì)胞以及不成熟的粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、DC等，可通過(guò)多種途徑抑制多種免疫細(xì)胞功能，從而下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答，其在人類(lèi)中通常被描述為 CD14-CD11b+，且缺乏 HLA-DR 表達(dá)［2］。近年來(lái)，MDSCs已為越來(lái)越多的研究者所熟知，其異常蓄積被認(rèn)為是腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制之一。正常情況下，MDSCs可分化為DC、巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞;而在某些病理情況下，MDSCs可在外周血、骨髓或病變部位募集、擴(kuò)增、活化，參與免疫逃逸、免疫耐受、炎癥反應(yīng)等病理過(guò)程。對(duì)包括胃癌在內(nèi)惡性腫瘤患者的研究［8，12］顯示，患者外周血 MDSCs比率較健康人顯著升高，并與腫瘤臨床分期相關(guān)，TNMⅣ期腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移者M(jìn)DSCs比率和絕對(duì)值最高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)胃癌患者外周血中的CD14+HLADR-/lowMDSCs行流式細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)其在單核細(xì)胞中所占比率顯著高于健康對(duì)照者，并與胃癌臨床分期相關(guān)。此外，胃癌患者外周血Treg細(xì)胞比率與MDSCs比率呈顯著正相關(guān)，提示MDSCs可能與Treg細(xì)胞共同作用，參與胃癌臨床進(jìn)展。已有研究證實(shí)，MDSCs可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化、擴(kuò)增，從而促進(jìn)其對(duì)免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控作用［2］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在外周血免疫抑制性細(xì)胞Treg、MDSCs高表達(dá)現(xiàn)象，兩者比率升高與胃癌臨床進(jìn)展相關(guān)，兩者間亦存在顯著相關(guān)性，提示兩者可能通過(guò)參與腫瘤免疫逃逸、抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展。腫瘤免疫逃逸機(jī)制眾多且復(fù)雜，Treg細(xì)胞與MDSCs在抑制胃癌抗腫瘤免疫中的相互作用仍不明確，有待深入研究。

1 Viguier M，Lema?tre F，Verola O，et al.Foxp3 expressing CD4+CD25(high)regulatory T cells are overrepresented in human metastatic melanoma lymph nodes and inhibit the function of infiltrating T cells［J］.J Immunol，2004，173(2):1444-1453.

2 江匯涓，邵宗鴻.MDSC的功能研究進(jìn)展與應(yīng)用前景［J］.臨床血液學(xué)雜志，2013，26(5):348-352.

3 Srivastava MK，Sinha P，Clements VK，et al.Myeloidderived suppressorcells inhibitT-cellactivation by depleting cystine and cysteine［J］.Cancer Res，2010，70(1):68-77.

4 Edge S，Byrd DR，Compton CC，et al.AJCC Cancer Staging Manual［M］.7th ed.New York:Springer，2010:117-126.

5 Zou W.Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance［J］.Nat Rev Cancer，2005，5(4):263-274.

6 Bhardwaj N.Harnessing the immune system to treat cancer［J］.J Clin Invest，2007，117(5):1130-1136.

7 Ohkura N，Hamaguchi M，Sakaguchi S.FOXP3+regulatory T cells:control of FOXP3 expression by pharmacological agents［J］.Trends Pharmacol Sci，2011，32(3):158-166.

8 朱立寧，徐岷，張尤歷，等.幽門(mén)螺桿菌感染誘導(dǎo)髓源抑制細(xì)胞在胃癌發(fā)生中的作用［J］.江蘇醫(yī)藥，2012，38(12):1404-1406.

9 Cao X，Cai SF，F(xiàn)ehniger TA，et al.Granzyme B and perforin are importantforregulatory T cell-mediated suppression of tumor clearance［J］.Immunity，2007，27(4):635-646.

10 Boissonnas A，Scholer-Dahirel A，Simon-Blancal V，et al.Foxp3+T cells induce perforin-dependent dendritic cell death in tumor-draining lymph nodes［J］.Immunity，2010，32(2):266-278.

11 Wing K，Onishi Y，Prieto-Martin P，et al.CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function［J］.Science，2008，322(5899):271-275.

12 Diaz-Montero CM，Salem ML，Nishimura MI，et al.Increased circulating myeloid-derived suppressor cells correlate with clinical cancerstage， metastatic tumorburden， and doxorubicin-cyclophosphamide chemotherapy［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(1):49-59.