葉 妮 陳衛(wèi)昌

蘇州大學附屬第一醫(yī)院特需病區(qū)1(215006) 消化內科2

腫瘤細胞具有逃避機體免疫系統(tǒng)殺傷的免疫逃逸能力，免疫細胞和細胞因子表達異常不僅可抑制宿主的抗腫瘤免疫應答，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，還可對腫瘤疫苗的抗腫瘤免疫作用產(chǎn)生干擾。Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg細胞)和髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)被認為是最為關鍵的參與腫瘤免疫逃逸機制的細胞亞群，研究表明CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞可在腫瘤微環(huán)境中聚集，抑制腫瘤特異性T細胞反應，從而阻礙抗腫瘤免疫應答［1］，而MDSCs可通過產(chǎn)生精氨酸酶1(ARG1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧簇(ROS)以及消耗胱氨酸和半胱氨酸等途徑抑制T細胞激活和T細胞介導的抗腫瘤免疫［2-3］。本研究通過檢測胃癌患者和健康對照者的外周血Treg細胞、MDSCs比率，并分析兩者與胃癌臨床病理特征的關系以及兩者間的相關性，初步探討Treg細胞和MDSCs在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、標本來源

收集2011年10月至2012年6月于蘇州大學附屬第一醫(yī)院就診的胃癌患者77例，入組患者胃癌診斷均經(jīng)胃鏡活檢或手術病理證實，其中男54例，女23例，年齡24～84歲，平均(62.10±12.83)歲。54例行手術治療者術前均未接受過放化療，術后病理均為胃腺癌，根據(jù)UICC/AJCC第7版胃癌TNM分期標準［4］，早期胃癌(ⅠA、ⅠB 期)10例，中晚期胃癌(ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB、Ⅳ期)44例。同期20例健康體檢者作為正常對照組，入組者排除心、肝、肺、腎等重要臟器疾病，肝腎功能正常，無腫瘤家族史，其中男10例，女10例，年齡58～79歲，平均(65.42±18.74)歲。兩組間性別構成和年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

二、主要試劑和儀器

熒光標記抗體 FITC-抗人 CD4、APC-抗人CD25、PE-抗人 Foxp3、PE-大鼠 IgG2a 同型對照和固定破膜劑、破膜緩沖液(eBioscience，Inc.)，熒光標記抗體 FITC-抗人 CD14、PE/Cy5-抗人 HLA-DR 和紅細胞裂解液(BioLegend，Inc.)，CytomicsTMFC 500流式細胞儀(Beckman Coulter，Inc.)。

三、方法

1.樣本采集:受試者于清晨抽取空腹外周血3 mL(手術患者于術前1 d采血)，EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離純化外周血單個核細胞(PBMC)。

2.流式細胞術檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞:將新鮮分離的PBMC配制成1×106個/100 μL的細胞懸液，加入FITC-抗人CD4和APC-抗人CD25各5 μL，4 ℃避光孵育 30 min，PBS 洗滌、棄上清;加入固定破膜劑1 mL混勻，常溫避光孵育45 min，加入破膜緩沖液 2 mL，離心、棄上清;加入 PE-抗人Foxp3或PE-大鼠IgG2a同型對照5 μL混勻，4℃避光孵育45 min，加入破膜緩沖液2 mL，離心、棄上清;加入PBS 300 μL，充分混勻后上流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞比率。

3.流式細胞術檢測MDSCs:取25 μL EDTA抗凝外周血，加入 FITC-抗人 CD14和 PE/Cy5-抗人HLA-DR 各0.25 μL，4 ℃ 避光孵育 30 min，加入紅細胞裂解液100 μL，37℃溫箱孵育10 min溶血，PBS洗滌，上流式細胞儀檢測CD14+HLA-DR-/lowMDSCs比率。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、外周血Treg細胞、MDSCs比率

對77例胃癌患者和20例健康對照者外周血標本的流式細胞檢測顯示，胃癌組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在CD4+T細胞中所占比率、MDSCs在單核細胞中所占比率均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Treg細胞:4.72%±1.01%對1.57%±0.99%，P＜0.01;MDSCs:21.72% ±10.12%對2.90% ±1.80%，P＜0.01)(圖1、圖2)。

圖1 各組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞流式圖

二、胃癌患者外周血Treg細胞、MDSCs比率與胃癌臨床病理特征的關系

對54例手術胃癌患者的統(tǒng)計分析顯示，患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的比率與胃癌臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移相關(P＜0.05);而外周血MDSCs占單核細胞的比率僅與胃癌臨床分期相關，中晚期胃癌患者MDSCs比率顯著高于早期胃癌患者(P＜0.05)，與胃癌浸潤深度和淋巴結轉移均無相關性(P＞0.05)(表1)。

三、胃癌患者外周血Treg細胞與MDSCs比率的相關性

Spearman等級相關分析顯示，胃癌組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比率與MDSCs比率呈顯著正相關(rs=0.681，P＜0.01)。

討 論

腫瘤具有潛在免疫原性，腫瘤患者體內存在腫瘤特異性免疫應答，然而腫瘤環(huán)境中的免疫抑制性網(wǎng)絡可使腫瘤逃避此種免疫應答，促進腫瘤進展并減弱免疫療法的療效［5］。近年，研究者開始關注腫瘤相關抑制性細胞，并相繼發(fā)現(xiàn)了多種免疫抑制性細胞，如調節(jié)性樹突細胞(DCreg)、腫瘤相關巨噬細胞、Treg細胞、MDSCs等，這些細胞參與腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受、免疫抑制等過程，抑制機體對腫瘤的免疫應答，從而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展［6-8］。

表1 胃癌患者外周血Treg細胞、MDSCs比率與胃癌臨床病理特征的關系(，%)

CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后中扮演重要角色，其在各種惡性腫瘤組織中呈過表達已逐漸得到證實。Treg細胞對機體抗腫瘤免疫的抑制作用呈細胞接觸依賴性，研究顯示Treg細胞可表達顆粒酶B和穿孔素，在腫瘤環(huán)境中，其活化可殺傷效應T細胞、自然殺傷細胞和DC［9-10］。此外，Treg細胞還可高表達細胞毒性T細胞相關抗原4(CTLA-4)，下調DC表面共刺激分子CD80/CD86表達，減少T細胞活化［11］。本研究流式細胞檢測結果顯示，胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在CD4+T細胞中所占比率顯著高于健康對照者，并與胃癌臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移相關。

MDSCs是一類未成熟的異質性髓系細胞群體，包括髓系前體細胞以及不成熟的粒細胞、單核巨噬細胞、DC等，可通過多種途徑抑制多種免疫細胞功能，從而下調機體免疫應答，其在人類中通常被描述為 CD14-CD11b+，且缺乏 HLA-DR 表達［2］。近年來，MDSCs已為越來越多的研究者所熟知，其異常蓄積被認為是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一。正常情況下，MDSCs可分化為DC、巨噬細胞或中性粒細胞;而在某些病理情況下，MDSCs可在外周血、骨髓或病變部位募集、擴增、活化，參與免疫逃逸、免疫耐受、炎癥反應等病理過程。對包括胃癌在內惡性腫瘤患者的研究［8，12］顯示，患者外周血 MDSCs比率較健康人顯著升高，并與腫瘤臨床分期相關，TNMⅣ期腫瘤廣泛轉移者MDSCs比率和絕對值最高。本實驗對胃癌患者外周血中的CD14+HLADR-/lowMDSCs行流式細胞分析，發(fā)現(xiàn)其在單核細胞中所占比率顯著高于健康對照者，并與胃癌臨床分期相關。此外，胃癌患者外周血Treg細胞比率與MDSCs比率呈顯著正相關，提示MDSCs可能與Treg細胞共同作用，參與胃癌臨床進展。已有研究證實，MDSCs可誘導Treg細胞分化、擴增，從而促進其對免疫反應的負調控作用［2］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在外周血免疫抑制性細胞Treg、MDSCs高表達現(xiàn)象，兩者比率升高與胃癌臨床進展相關，兩者間亦存在顯著相關性，提示兩者可能通過參與腫瘤免疫逃逸、抑制抗腫瘤免疫應答促進胃癌發(fā)生、發(fā)展。腫瘤免疫逃逸機制眾多且復雜，Treg細胞與MDSCs在抑制胃癌抗腫瘤免疫中的相互作用仍不明確，有待深入研究。

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