崔小蘭 李大偉 夏 強

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院肝臟外科(200127)

急性肝功能衰竭(AHF)是多種因素作用引起的一組臨床綜合征，具有較高病死率。除肝移植外，目前尚無有效的治療方法，因此，早期干預AHF具有重要的研究價值和臨床意義。尼克酰胺是一種水溶性B3組維生素，可從膳食中獲取，也可通過煙酸合成。內(nèi)源性尼克酰胺參與廣泛的生物代謝過程，包括能源合成和脂肪酸合成等［1］。多年來，尼克酰胺已被用于治療各種疾病，如糙皮病、銀屑病、精神分裂癥、Ⅰ型糖尿病等［2-4］。最近，諸多文獻報道尼克酰胺在體內(nèi)和體外均具有抗炎作用，可減少脂多糖(LPS)引起的炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6的釋放，以及對丙酸桿菌引起角化細胞趨化因子IL-8生成的抑制［5-7］。在內(nèi)毒素引起的肺部炎癥小鼠模型中，尼克酰胺明顯可降低肺部炎性細胞和炎癥因子水平。此外，尼克酰胺對心臟缺血再灌注損傷和腦創(chuàng)傷均有保護作用［8-9］。本文旨在研究尼克酰胺在AHF小鼠模型中是否也有抑制炎癥和保護的作用。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

1.實驗動物:雄性C57BL/6小鼠94只，8～12周，體質(zhì)量20～26 g，無固定病原體級，購自中國科學院上海實驗動物中心。晝夜規(guī)律光照，小鼠自由進食、進水。

2.儀器和試劑:D-半乳糖胺、LPS來源于大腸桿菌，尼克酰胺購自美國Sigma公司;TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購自深圳市達科為生物技術(shù)公司;肝細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗Cleaved-Caspase-3抗體(1∶200稀釋)購自美國Cell Signaling Technology公司;β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

二、動物分組以及AHF模型制備

1.基礎實驗:抽取54只小鼠按隨機表法分為6組，每組9只?？瞻讓φ战M小鼠未給予任何處理;尼克酰胺對照組小鼠腹腔注射尼克酰胺1000 mg/kg;將D-半乳糖胺700 mg/kg和 LPS 10 μg/kg溶解于0.2 mL 0.9%NaCl溶液后腹腔注射制備 AHF模型;尼克酰胺低、中、高劑量組小鼠分別腹腔注射尼克酰胺400、800、1000 mg/kg 1 h后制備AHF模型。

2.生存率實驗:將剩余40只小鼠隨機分為5組，每組各8只。AHF模型組建模方法同上文;0.9%NaCl溶液組:建模前 1 h腹腔注射 0.2 mL 0.9%NaCl溶液;尼克酰胺低、中、高劑量組:建模前1 h分別腹腔注射尼克酰胺400、800、1000 mg/kg。

三、檢測指標

1.基礎實驗指標的檢測:建模6 h后，6組小鼠腹主動脈采血，室溫靜置1 h后2000×g 4℃離心30 min，分離血清，測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。門靜脈灌注4%多聚甲醛固定小鼠肝組織，梯度濃度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，HE染色，于光鏡下觀察肝組織病理學改變。采用ELISA法檢測TNF-α和IL-6水平;采用TUNEL染色，熒光共聚焦顯微鏡下觀察肝細胞凋亡并拍照。留取部分肝組織提總蛋白，以蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-3表達。

2.生存率觀察:觀察5組小鼠于建模后72 h內(nèi)的死亡情況和死亡時間。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、血清轉(zhuǎn)氨酶水平

空白對照組ALT和AST水平與尼克酰胺對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AHF模型組ALT［(2799.00 ±384.35)U/L］和 AST［(3362.78 ±483.05)U/L］較兩個對照組明顯增高(P ＜0.05)。與AHF模型組相比，尼克酰胺低、中、高劑量組ALT和AST水平顯著降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性(P ＜0.05)(圖1)。

二、肝組織病理學檢查

空白對照組和尼克酰胺對照組肝細胞呈條索狀排列，肝竇排列規(guī)則，未見炎性細胞浸潤;AHF模型組肝細胞腫脹，肝竇嚴重淤血，可見片狀壞死和散在的中性粒細胞浸潤;與AHF模型組相比，尼克酰胺不同劑量組肝組織損傷減輕，肝細胞腫脹明顯減輕，肝竇淤血少見，未見壞死，少量中性粒細胞浸潤(圖2)。

三、血清炎癥因子水平

空白對照組TNF-α和IL-6水平與尼克酰胺對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);AHF模型組分別為(1408.67 ±139.84)pg/mL 和(3408.67 ±167.49)pg/mL，較兩個對照組明顯升高(P＜0.05)。與AHF模型組相比，尼克酰胺低、中、高劑量組TNF-α和IL-6水平均顯著降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性(P＜0.05)(圖3)。

圖1 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平

圖2 各組肝組織病理學表現(xiàn)(HE染色，×200)

圖3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平

四、肝細胞凋亡和肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達情況

與空白對照組相比，尼克酰胺對照組肝細胞凋亡和肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達無明顯差異。與兩個對照組相比，AHF模型組肝細胞凋亡和肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達均明顯升高(P＜0.05)。與AHF模型組相比，尼克酰胺低、中、高劑量組肝細胞凋亡和Caspase-3蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性(P ＜0.05)(圖4、5)。

五、小鼠生存情況

AHF模型組和0.9%NaCl溶液組8只小鼠于72 h內(nèi)均死亡，生存率為0%。尼克酰胺低、中、高劑量組72 h內(nèi)分別死亡5只、3只和0只小鼠，生存率分別為37.5%、62.5%和100%，較AHF模型組和0.9%NaCl溶液組明顯增加，死亡率明顯減少(P ＜0.05)(圖6)。

討 論

AHF的病理特點是肝細胞在短期內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，臨床特點是肝功能迅速惡化，引起肝性腦病、凝血功能障礙等急性并發(fā)癥，病情進展迅速，死亡率高。D-半乳糖胺聯(lián)合LPS腹腔注射誘導AHF小鼠模型是研究急性肝損傷十分理想的動物模型，有利于治療的評估和潛在致病機制的研究［10-12］。血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST是評價肝損傷的重要指標，兩者水平高低可提示肝損傷的嚴重程度［13］。本研究顯示，尼克酰胺可顯著降低小鼠血清ALT和AST水平，對急性肝損傷有保護作用，肝組織病理結(jié)果進一步證實了這種保護作用。TNF-α是D-半乳糖胺聯(lián)合LPS誘導的急性肝損傷中最主要的炎癥介質(zhì)，可引起炎癥介質(zhì)的級聯(lián)反應，導致大量肝細胞凋亡和壞死［14-15］。有文獻［16］報道，抑制 TNF-α 的合成和釋放可減輕肝損傷。IL-6也是D-半乳糖胺聯(lián)合LPS誘導的急性肝損傷中重要的炎癥因子，肝損傷后伴隨TNF-α和IL-6明顯升高［17-21］。目前認為導致AHF的機制為D-半乳糖胺特異性地將肝細胞磷酸尿嘧啶核苷消耗殆盡，LPS引起肝臟Kupffer細胞高度活化，從而使其釋放大量活性介質(zhì)，如TNF-α和IL-6等，最終導致肝細胞彌漫性壞死、凋亡，肝功能嚴重障礙甚至發(fā)生器官衰竭［22-24］。尼克酰胺是B族維生素成員，文獻報道尼克酰胺有明顯的抑制炎癥作用，可減少炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，明顯減輕肝細胞壞死和凋亡［25］。本研究通過預先腹腔注射不同劑量的尼克酰胺，觀察小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、TNF-α和IL-6水平、肝臟病理損傷和生存率，旨在評價尼克酰胺對AHF的作用。結(jié)果顯示，尼克酰胺能明顯降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平和TNF-α、IL-6水平，肝組織病理損傷明顯減輕;尼克酰胺預處理能明顯降低肝組織內(nèi)凋亡相關蛋白Caspase-3的表達水平，減少肝細胞凋亡，并明顯提高小鼠生存率。

圖4 各組肝細胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

圖5 各組小鼠肝組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)

圖6 各組小鼠生存率情況

綜上所述，尼克酰胺通過抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，減輕肝損傷時的炎癥反應，同時抑制肝細胞凋亡，從而保護D-半乳糖胺聯(lián)合LPS引起的急性肝損傷，具有潛在的臨床治療作用。

1 Sauve AA.NAD+and vitamin B3:from metabolism to therapies［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，324(3):883-893.

2 Maiese K，Chong ZZ，Hou J，et al.The vitamin nicotinamide:translating nutrition into clinical care［J］.Molecules，2009，14(9):3446-3485.

3 Niren NM.Pharmacologic doses of nicotinamide in the treatment of inflammatory skin conditions:a review［J］.Cutis，2006，77(1 Suppl):11-16.

4 Namazi MR.Nicotinamide:a potential addition to the antipsoriatic weaponry［J］.FASEB J，2003，17(11):1377-1379.

5 Biedroń R，Ciszek M，Tokarczyk M，et al.1-Methylnicotinamide and nicotinamide:two related anti-inflammatory agents that differentially affect the functions of activated macrophages［J］.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2008，56(2):127-134.

6 Grange PA，Raingeaud J，Calvez V，et al.Nicotinamide inhibits propionibacterium acnes-induced IL-8 production inkeratinocytesthrough the NF-kappaB and MAPK pathways［J］.J Dermatol Sci，2009，56(2):106-112.

7 Fernandes CA，F(xiàn)ievez L，Ucakar B，et al.Nicotinamide enhances apoptosis of G(M)-CSF-treated neutrophils and attenuates endotoxin-induced airway inflammation in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，300(3):L354-L361.

8 Sukhodub A，Du Q，Jovanovic S，et al.Nicotinamide-rich diet protects the heart against ischaemia-reperfusion in mice:a crucial role for cardiac SUR2A［J］.Pharmacol Res，2010，61(6):564-570.

9 Goffus AM，Anderson GD，Hoane M.Sustained delivery of nicotinamide limits cortical injury and improves functional recovery following traumatic brain injury［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3(2):145-152.

10 Wan JY，Gong X，Zhang L，et al.Protective effect of baicalin against lipopolysaccharide/D-galactosamineinduced liver injury in mice by up-regulation of heme oxygenase-1［J］.Eur J Pharmacol，2008，587(1-3):302-308.

11 Wang K，Damjanov I，Wan YJ.The protective role of pregnane X receptor in lipopolysaccharide/D-galactosamineinduced acute liver injury［J］.Lab Invest，2010，90(2):257-265.

12 Lin X，Zhang S，Huang R，et al.Protective effect of tormentic acid from Potentilla chinensis against lipopolysaccharide/D-galactosamine induced fulminant hepatic failure in mice［J］.Int Immunopharmacol，2014，19(2):365-372.

13 Nyblom H，Berggren U，Balldin J，et al.High AST/ALT ratio may indicate advanced alcoholic liver disease rather than heavy drinking［J］.Alcohol Alcohol，2004，39(4):336-339.

14 Lee WC，Jung HA，Choi JS，et al.Protective effects of luteolin against apoptotic liver damage induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide in mice［J］.J Nat Prod，2011，74(9):1916-1921.

15 Yu DS，An FM，Gong BD，et al.The regulatory role of microRNA-1187 in TNF-alpha-mediated hepatocyte apoptosis in acute liver failure［J］.Int J Mol Med，2012，29(4):663-668.

16 Iimuro Y，Gallucci RM，Luster MI，et al.Antibodies to tumor necrosis factor alfa attenuate hepatic necrosis and inflammation caused by chronic exposure to ethanol in the rat［J］.Hepatology，1997，26(6):1530-1537.

17 Ben-Ari Z，Zilbermints V，Pappo O，et al.Erythropoietin increases survival and attenuates fulminant hepatic failure injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide in mice［J］.Transplantation，2011，92(1):18-24.

18 Xia X，Su C，F(xiàn)u J，et al.Role of alpha-lipoic acid in LPS/d-GalN induced fulminant hepatic failure in mice:studies on oxidative stress，inflammation and apoptosis［J］.Int Immunopharmacol，2014，22(2):293-302.

19 Liu H，Wu X，Dong Z，et al.Fatty acid synthase causes drug resistance by inhibiting TNF-alpha and ceramide production［J］.J Lipid Res，2013，54(3):776-785.

20 McGrath KC，Li XH，Whitworth PT，et al.High density lipoproteins improve insulin sensitivity in high-fat diet-fed mice by suppressing hepatic inflammation［J］.J Lipid Res，2014，55(3):421-430.

21 Yu H，Valerio M，Bielawski J.Fenretinide inhibited de novo ceramide synthesis and proinflammatory cytokines induced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans［J］.J Lipid Res，2013，54(1):189-201.

22 Xu FL，You HB，Li XH，et al.Glycine attenuates endotoxininduced liver injury by downregulating TLR4 signaling in Kupffer cells［J］.Am J Surg，2008，196(1):139-148.

23 Liu LM，Zhang JX，Luo J，et al.A role of cell apoptosis in lipopolysaccharide(LPS)-induced nonlethal liver injury in D-galactosamine(D-GalN)-sensitized rats［J］.Dig Dis Sci，2008，53(5):1316-1324.

24 Ganz M，Csak T，Nath B，et al.Lipopolysaccharide induces and activates the Nalp3 inflammasome in the liver［J］.World J Gastroenterol，2011，17(43):4772-4778.25 Yuan H，Wan J，Li L，et al.Therapeutic benefits of the group B3 vitamin nicotinamide in mice with lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis［J］.Pharmacol Res，2012，65(3):328-337.