溫乃健

【摘要】目的：探討地中海貧血高風(fēng)險(xiǎn)兒童β-地中海貧血基因的檢測(cè)后的檢出率，和該基因的構(gòu)成情況，并提出有效的防治策略以降低β-地中海貧血發(fā)生概率。方法：150例地中海貧血高風(fēng)險(xiǎn)兒童采取雙重PCR技術(shù)和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（PDB）進(jìn)行β-地中海貧血基因檢測(cè)、分析。結(jié)果：在150例受檢兒童中，檢測(cè)出β-地中海貧血兒童49例，占總數(shù)的30%左右，涉及基因突變類(lèi)型8種。結(jié)論：不同基因類(lèi)型具有不同的臨床表現(xiàn)，β-地貧純合子和雙重雜合子具有嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，需要制定有效措施來(lái)降低這兩種類(lèi)型兒童的出生率，提高人口素質(zhì)。

【關(guān)鍵詞】地中海貧血；β-地中海貧血基因；兒童

【中圖分類(lèi)號(hào)】R725.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）03-0556-02

1、引言

地中海貧血是一組遺傳性溶血性貧血疾病，具有高發(fā)病率，由于存在遺傳的基因缺陷，使得血紅蛋白中一種或多種珠蛋白鏈合成減少或不足，其中 -地中海貧血和β-地中海貧血最常見(jiàn)，占有的比例最高。地中海貧血廣泛分布于世界各地，最嚴(yán)重地區(qū)是東南亞，在我國(guó)多數(shù)集中在廣東、廣西、四川等地，長(zhǎng)江以南各省區(qū)只有少數(shù)幾例，再往北則更加少見(jiàn)，具有明顯的種族和地域差異性。β-地中海貧血較常出現(xiàn)在兒童身上，發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響兒童的身體健康發(fā)育和心理成長(zhǎng)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。必須采取預(yù)防控制措施，有效降低我國(guó)高發(fā)地區(qū)的發(fā)病情況。

2、資料與方法

2.1 一般資料

150例地中海貧血高風(fēng)險(xiǎn)兒童均為我院2013年5月至2014年12月期間檢測(cè)病人，其中男98例，女52例，年齡普遍在10d～12歲之間。所有病患采取空腹抽外周血2ml，采取EDTA-K2抗凝，血樣在4oC下保存。

試劑：人全血基因組DNA提取試劑盒、β-地中海貧血診斷試劑盒

儀器：TGRADIENT溫度梯度PCR儀器、高壓雙穩(wěn)電泳儀、瓊脂糖水平電泳槽、凝膠圖像處理系統(tǒng)等。

2.2 方法

（1）診斷

對(duì)150例患者提取人全血基因組DNA，一切按照該試劑的操作說(shuō)明操作。再進(jìn)行單管二重PCR反應(yīng)測(cè)試，反應(yīng)結(jié)果顯示94oC總變性4min；94oC 60s，56oC 30s，74oC 60s，一共經(jīng)歷34個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后74oC達(dá)到總延伸4min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析：選用適量6 溴酚藍(lán)上樣緩沖液和擴(kuò)增產(chǎn)物3 進(jìn)行混合均勻，在2.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行上樣，后在70V電泳下操作40min，用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行樣品觀察，如樣品中同時(shí)存在600bp 和200bp 各1條，則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（2）雜交

選用15ml的塑料離心管進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，并對(duì)離心管標(biāo)注受試者編號(hào)，在離心管內(nèi)放入相應(yīng)的患者雜交膜條，添加10ml雜交液，再添加相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，后封閉離心管。將塑料離心管在沸水中進(jìn)行10min的加熱處理，再在42oC 的雜交箱內(nèi)進(jìn)行5h的雜交。

（3）洗膜

雜交完成后將離心管內(nèi)的膜條取出，放入42oC的洗膜液中，進(jìn)行30min的輕搖洗滌。

（4）顯色

選取雜交液按照1：4000比例進(jìn)行適量的POD溶液配制，將膜條放入溶液中輕搖浸泡30min，再用適量雜交液進(jìn)行膜條的5min輕搖洗滌2次，后用檸檬酸鈉液再次對(duì)膜條進(jìn)行2min的輕搖洗滌2次，以上過(guò)程全部在室溫完成。將取出的膜條浸入到最新配制的顯色液中進(jìn)行15min的避光顯色操作，完成后的膜條迅速在純水中漂洗，后判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種檢測(cè)方法可同時(shí)檢測(cè)中國(guó)人基因中的8種常見(jiàn)的和9種少見(jiàn)的β-地中海貧血基因突變位點(diǎn)。

（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)膜條上相應(yīng)探針位置，判斷是否存在藍(lán)色斑點(diǎn)。一般結(jié)果有幾下幾種：1）只有突變型探針位置存在藍(lán)色斑點(diǎn)，則為純合突變型，該基因點(diǎn)位同時(shí)在兩個(gè)等位基因處發(fā)生了基因突變；2）突變型探針位置不存在藍(lán)色斑點(diǎn)而野生型探針位置存在藍(lán)色斑點(diǎn)，則為雜合突變型，該基因點(diǎn)位只有一個(gè)等位基因處發(fā)生了基因突變；3）只有野生型探針位置存在藍(lán)色斑點(diǎn)，則為野生型，沒(méi)有發(fā)生基因突變。

3、結(jié)果

通過(guò)PCR-PDB方法對(duì)150例地中海貧血患者進(jìn)行診斷，結(jié)果為β-地中海貧血基因型正常的兒童有101例，占70%左右，而患有β-地中海貧血的兒童有49例，占30%左右。存在的基因突變類(lèi)型有8種：CD43（G T），CD26（G A），CD17（A T），CD41-42（-TCTT），-28（A G），CD71-72（+A），-29（A G），IVS-Ⅱ-654（C T）。

4、討論

地中海貧血是一種發(fā)病率極高的高風(fēng)險(xiǎn)單基因遺傳病，β-地中海貧血是最主要的一種地中海貧血類(lèi)型，也是患病率較高的一種。β-地中海貧血的臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，基本上有輕、中、重型三種，不同的基因突變形成的臨床表現(xiàn)不同，β-地中海貧血純合子和雙重雜交合子的臨床表現(xiàn)最為嚴(yán)重，重度貧血且發(fā)病期早，容易形成肝、脾腫大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是存在CD17和 CD43這種可以產(chǎn)生無(wú)意義的密碼子突變現(xiàn)象，而其他的CD27-28、CD41-42、28/CD71-72存在移碼突變，使得閱讀框架發(fā)生變化，影響β珠蛋白肽鏈的正常合成，使其提前終止合成，而654則影響RNA加工，使β珠蛋白肽鏈合成存在障礙等。其中IVS-Ⅱ-654（C T）突變型是最常見(jiàn)的，之后是CD41-42（-TCTT），CD17（A T），-28（A G），這四種突變類(lèi)型占全部類(lèi)型中的90%左右

本文的研究對(duì)象是地中海貧血高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的兒童，其β-地中海貧血檢出率比其他地區(qū)要高，但不能說(shuō)明實(shí)際發(fā)病率一定也這么高。廣東、廣西、四川等地是我國(guó)地中海貧血高檢出地方，也是較高發(fā)病率地點(diǎn)，人口密度基數(shù)在我國(guó)南方屬于人口密集處，必須制定可行的防止措施降低β-地中海貧血患兒的出生率，如根據(jù)四種突變類(lèi)型最高的基因型提高產(chǎn)前診斷、開(kāi)展遺傳咨詢等，提高我國(guó)人口質(zhì)量。

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