馬書梅

【摘要】目的 研究視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（RIRI）中凋亡相關(guān)基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2表達(dá)的變化，探討其作用機(jī)制。方法將28只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、缺血組，其中缺血組又分為再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6個(gè)組。建立RIRI動(dòng)物模型，用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測(cè)再灌注后不同時(shí)段視網(wǎng)膜組織中WTp53、bax和bcl-2基因表達(dá)的變化。結(jié)果 缺血組視網(wǎng)膜再灌注后WTp53、Bax蛋白表達(dá)增加，與正常組比較，再灌注6～72 h差異有顯著意義（ F=487.19、281.97，q=11.526～ 52.401 ，P lt；0.05）。缺血組視網(wǎng)膜再灌注后Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯變化，與正常組比較，差異無顯著性（ P gt；0.05）。結(jié)論 缺血再灌注損傷引起WTp53、bax基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層與內(nèi)核層表達(dá)增高；WTp53和bax可能通過誘導(dǎo)或促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡參與了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 視網(wǎng)膜；再灌注損傷；基因，WTp53；基因，bax；基因，bcl-2；大鼠，Wistar

【中圖分類號(hào)】R774.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）03-0248-02

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科常見的病理過程，嚴(yán)重影響病人視功能。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，已成為近年眼科的研究熱點(diǎn)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中存在著神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且凋亡是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞丟失的重要因素之一[1]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，研究凋亡相關(guān)基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2的表達(dá)變化，探討視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物及分組 健康無眼疾的Wistar大鼠（青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）28只，體質(zhì)量250～300 g，雌雄不拘，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。隨機(jī)分為兩組：正常組（4只）、缺血再灌注組（24只），其中缺 血再灌注組又分為再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6個(gè)組，每組4只大鼠。

1.1.2主要試劑 兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司生產(chǎn)），鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）免疫組化試劑盒（武漢Boster生物工程公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立 采用前房穿刺加壓法建立大鼠缺血再灌注損傷模型，方法見文獻(xiàn)[2]。

1.2.2標(biāo)本的取材、固定與切片 分別于再灌注后1、6、12、24、48、72 h處死動(dòng)物，摘除眼球，制作石蠟切片，方法見文獻(xiàn)[2]。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色 將標(biāo)本的石蠟切片脫蠟至水，用蒸餾水新鮮配制體積分?jǐn)?shù)0.03過氧化氫室溫放置10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，復(fù)合消化液室溫浸浴10 min修復(fù)抗原，正常山羊血清室溫 10 min封 閉非特異性抗原，加一抗（兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗） 37 ℃孵育2 h， 加二抗（生物素化山羊抗兔IgG）37 ℃水浴20 min，SABC法染色，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.2.4結(jié)果觀察及數(shù)據(jù)處理 每只眼球取兩張切片進(jìn)行分析，應(yīng)用雙目光學(xué)顯微鏡（400倍）分別觀察WTp53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)（陽性染色呈棕黃色）。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化切片進(jìn)行圖像分析（每張切片取4個(gè)視野，以視神經(jīng)為基準(zhǔn)分別向兩側(cè)各取2個(gè)視野），對(duì)視網(wǎng)膜組織中WTp53和Bax蛋白表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果

2.1WTp53蛋白的表達(dá)變化 正常大鼠視網(wǎng)膜中幾乎無WTp53蛋白表達(dá)。WTp53蛋白于再灌注6 h開始在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層少量表達(dá)，位于細(xì)胞核內(nèi)，以后表達(dá)量逐漸增加，24 h達(dá)到高峰，此時(shí)除在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有強(qiáng)表達(dá)外，內(nèi)核層也有散在的表達(dá)；48 h仍持續(xù)強(qiáng)表達(dá)； 72 h明 顯下降，但仍較正常組為高。再灌注6、12、24、48、72 h的WTp53蛋白陽性表達(dá)結(jié)果與正常組比較，差異有顯著性。見表1。

2.2 Bax蛋白的表達(dá)變化 正常大鼠視網(wǎng)膜中幾乎無Bax蛋白表達(dá)。Bax蛋白于再灌注6 h開始在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有表達(dá)，位于細(xì)胞漿中，以后表達(dá)量逐漸增加，24 h達(dá)到高峰，此時(shí)除在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有強(qiáng)表達(dá)外，內(nèi)核層也有散在表達(dá)；48 h已有所下降，但仍表達(dá)較強(qiáng)；72 h明顯下降。再灌注6、12、24、48、72 h的Bax蛋白陽性表達(dá)結(jié)果與正常組比較，差異有顯著性。見表1。

2.3Bcl-2蛋白的表達(dá)變化 正常組視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白低表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層及內(nèi)核層。缺血再灌注后各時(shí)間段表達(dá)差異無顯著性。再灌注6、12、24、48、78 h的Bcl-2蛋白陽性表達(dá)結(jié)果與正常組比較，差異無顯著性（ P gt；0.05）。見表1。

表1 視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)段WTp53、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化（略）

與正常組比較， F=487.19，281.97，* q=11.526～52.401， P lt； 0.05