郭松 趙超 傅明駿 江世貴 楊其彬 邱麗華

摘要 ?[目的]利用卵巢組織石蠟切片自發(fā)熒光觀察斑節(jié)對(duì)蝦卵母細(xì)胞發(fā)育。[方法] 研究采用普通石蠟切片技術(shù)獲得斑節(jié)對(duì)蝦發(fā)育各期卵巢組織切片，采用蘇木青/伊紅染色后利用3種自發(fā)熒光對(duì)卵巢組織切片進(jìn)行觀察，探討綠色自發(fā)熒光下觀察卵母細(xì)胞不同發(fā)育階段需要的最適曝光時(shí)間。[結(jié)果] 卵巢組織切片直接自發(fā)熒光觀察卵母細(xì)胞的發(fā)育較HE染色后觀察更為方便、有效，且切片可以繼續(xù)用于后續(xù)試驗(yàn)。3種自發(fā)熒光中，綠色自發(fā)熒光的觀察效果最好。[結(jié)論] ?該研究可為快速觀察斑節(jié)對(duì)蝦卵母細(xì)胞發(fā)育和高效利用試驗(yàn)材料提供了新思路和新方法。

關(guān)鍵詞 斑節(jié)對(duì)蝦;卵母細(xì)胞發(fā)育;組織切片;自發(fā)熒光

中圖分類號(hào) S945.4+7 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A ?文章編號(hào) 0517-6611（2015）03-136-06

Study on the Autofluorescence of Paraffin Section of Penaeus monodon

GUO Song¹， 2， ZHAO Chao¹， 3， FU Mingjun¹， 3， QIU Lihua¹， 3* et al

（1. South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou， Guangdong 510300; 2. College of Aqua-life Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization， Ministry of Agriculture， Guangzhou， Guangdong 510300）

Abstract ? ? [Objective] The ovarian development of Penaeus monodon was observed by using auto-fluorescence of oocyte paraffin section. [Method] The paraffin section of ovary in P. monodon indifferent development stages by using common paraffin section technology. The ovary sections were observed by using three kinds of auto-fluorescences after hematoxylin and eosin dyeing. The optimum exposure time for different development stages of oocytes under green auto-fluorescence was discussed. [Result] It was more convenient and effective to observe the development of oocyte by using auto-fluorescence of ovary sections than that by HE dyeing. And the sections could be used in further experiments. Among three kinds of auto-fluorescence， the observation effects by using green auto-fluorescence was the best. [Conclusion]The research could provide new thought and method for the rapidly observing the development of P. monodon oocytes and effectively utilizing the test materials.

Key words ? Penaeus monodon; Oocyte development; Tissue sections; Auto-fluorescence

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101903）;廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（A201300B03）;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B04 0402016）;海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)（ZDXM2014057）;海南省自然科學(xué)基金（313117）。

作者簡(jiǎn)介 郭松（1987- ），男，河南淮濱人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究。

收稿日期 20141119

斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）作為世界三大對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一^[1-3]，在國(guó)內(nèi)外都有著大量研究報(bào)道。斑節(jié)對(duì)蝦的全人工繁育技術(shù)已經(jīng)成功，但斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的分子機(jī)理仍然不十分清楚。近年來(lái)，已有多個(gè)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育相關(guān)的基因被研究^[4-7]，組織切片觀察是目前常用的鑒定卵母細(xì)胞發(fā)育的方法，以卵巢組織切片為基礎(chǔ)的免疫組化、原位雜交等技術(shù)廣泛應(yīng)用于在研究卵巢發(fā)育相關(guān)因子在卵母細(xì)胞中的定位等研究中。目前采用的蘇木青/伊紅染色后觀察操作繁瑣且不利于切片的再利用，因此能夠不通過(guò)染色直接通過(guò)切片鑒定卵巢組織切片卵母細(xì)胞的發(fā)育成為十分實(shí)用的方法。筆者首次在斑節(jié)對(duì)蝦中報(bào)道卵巢組織切片自發(fā)光及其應(yīng)用，采用普通石蠟切片技術(shù)獲得斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育各期卵巢組織切片，采用HE染色和卵巢組織切片自發(fā)熒光對(duì)切片進(jìn)行了觀察，并比較了各自的優(yōu)缺點(diǎn);利用3種熒光對(duì)觀察卵巢組織切片，比較3種熒光的觀察效果，并對(duì)綠色自發(fā)熒光最適曝光時(shí)間進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斑節(jié)對(duì)蝦來(lái)源于海南省三亞市野生捕撈，體重80～200 g，水溫（25±1）℃、鹽度為30‰的循環(huán)水池中暫養(yǎng)7 d。取發(fā)育至各期的卵巢中葉部分用Bouin氏液固定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織切片。

用Bouin氏液固定樣品24 h以上，流水浸泡2 h去除固定液，參照用 Bell方法 ^[8] 進(jìn)行染色、切片和組織學(xué)觀察。脫水使用Leica4-2429自動(dòng)脫水機(jī)完成，LeicaEG1160組織包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋，Leica轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)切片，切片厚度設(shè)定為4 μm，使用LeicaAUTOSTAINER·XL染色機(jī)進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2.2 顯微鏡觀察。

HE染色切片在ZEISS光學(xué)顯微鏡下觀察并于適當(dāng)倍數(shù)下拍照。未經(jīng)任何處理的石蠟切片在AMG EVOS f1（LIFE，USA）熒光顯微鏡下觀察并于適當(dāng)倍數(shù)下拍照。3種熒光均是在60%光強(qiáng)、曝光250 ms下拍照;綠色自發(fā)熒光在不同曝光時(shí)間下觀察卵母細(xì)胞發(fā)育不同狀態(tài)，采用的是100%光強(qiáng)比較不同曝光時(shí)間下的拍照效果;熒光照片采用60%光強(qiáng)，曝光250 ms。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種熒光觀察效果的比較 從圖1 可以看出，核仁期細(xì)胞和周邊核仁期細(xì)胞在3種波段光的激發(fā)下呈現(xiàn)較為均勻的顏色，細(xì)胞核呈現(xiàn)黑色。卵黃囊卵母細(xì)胞和早期以及晚期的皮質(zhì)棒期，綠色自發(fā)熒光能夠較好地展示顆粒狀的物質(zhì)。皮質(zhì)棒狀體在3種自發(fā)熒光下呈現(xiàn)為黑色。在相同的曝光時(shí)間和光強(qiáng)下，3種顏色的自發(fā)熒光都可用于卵巢組織切片卵母細(xì)胞發(fā)育的觀察。3種顏色的自發(fā)熒光中，綠色自發(fā)熒光在清晰度和觀察范圍上比紅色和藍(lán)色自發(fā)熒光好。

注：CN.染色質(zhì)核仁期卵母細(xì)胞;PO.周邊核仁期卵母細(xì)胞;YO.卵黃囊卵母細(xì)胞;CR.皮質(zhì)桿狀細(xì)胞。

圖1 卵巢組織切片在3種熒光下自發(fā)熒光效果的比較

2.2 綠色熒光不同曝光時(shí)間下觀察發(fā)育至各個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞

從圖2可以看出，在曝光時(shí)間為250 ms時(shí)觀察效果最好，500 ms時(shí)出現(xiàn)曝光過(guò)度;從圖3可以看出，在綠色自發(fā)熒光下觀察卵黃囊卵母細(xì)胞需要曝光250 ms;從圖4～5可以看出，在皮質(zhì)棒期的卵母細(xì)胞，只需要60 ms曝光即可得到較好的觀察效果。在60 ms曝光時(shí)間下，卵母細(xì)胞發(fā)育的不同形態(tài)均可以得到較為清晰的觀察。

2.3 綠色熒光自發(fā)熒光與常規(guī)HE染色的效果比較

從圖6可以看出，利用組織自發(fā)綠色自發(fā)熒光與常規(guī)HE染色相比能夠更好地觀察卵母細(xì)胞中的顆粒，且色彩鮮艷美觀。在發(fā)育早期的卵母細(xì)胞中，常規(guī)HE染色觀察結(jié)果背景較深;在卵黃囊卵母細(xì)胞期自發(fā)綠色自發(fā)熒光較好地展現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)中的顆粒狀物質(zhì)及其分布的位置;在早期和晚期的皮質(zhì)棒卵母細(xì)胞中，2種方法都能夠很好地展示細(xì)胞中的皮質(zhì)棒結(jié)

注：A.曝光時(shí)間15 ms;B.曝光時(shí)間30 ms;C.曝光時(shí)間60 ms;D.曝光時(shí)間120 ms;E.曝光時(shí)間250 ms;F.曝光時(shí)間500 ms。

圖2 綠色自發(fā)熒光下觀察核仁期細(xì)胞和周邊核仁期細(xì)胞（20×）

注：A.曝光時(shí)間15 ms;B.曝光時(shí)間30 ms;C.曝光時(shí)間60 ms;D.曝光時(shí)間120 ms;E.曝光時(shí)間250 ms;F.曝光時(shí)間500 ms。

圖3 綠色自發(fā)熒光下觀察卵黃囊卵母細(xì)胞（10×）

注：A.曝光時(shí)間15 ms;B.曝光時(shí)間30 ms;C.曝光時(shí)間60 ms;D.曝光時(shí)間120 ms;E.曝光時(shí)間250 ms;F.曝光時(shí)間500 ms。

圖4 綠色自發(fā)熒光下觀察卵黃囊卵母細(xì)胞早期皮質(zhì)棒期卵母細(xì)胞（10×）

注：A.曝光時(shí)間15 ms;B.曝光時(shí)間30 ms;C.曝光時(shí)間60 ms;D.曝光時(shí)間120 ms;E.曝光時(shí)間250 ms;F.曝光時(shí)間500 ms。

圖5 綠色自發(fā)熒光下觀察晚期皮質(zhì)棒期卵母細(xì)胞（10×）

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

構(gòu)，但在皮質(zhì)棒間隙中的顆粒狀物質(zhì)的展示上，組織自發(fā)綠色熒光的觀察效果優(yōu)于常規(guī)HE染色。

3 討論

海洋生物或者其組織能夠激發(fā)后發(fā)出熒光是較為普遍的現(xiàn)象，如目前廣泛應(yīng)用的綠色熒光蛋白（GFP）^[9-12]。與生物發(fā)光現(xiàn)象不同，自發(fā)熒光一般需要熒光蛋白被一定范圍波長(zhǎng)的激光激發(fā)。熒光蛋白主要應(yīng)用在與抗體、生物素、免疫蛋白等物質(zhì)結(jié)合作為熒光探針，通過(guò)激發(fā)發(fā)出的熒光對(duì)相關(guān)物質(zhì)的分布等進(jìn)行研究。斑節(jié)對(duì)蝦卵巢組織石蠟切片能夠自發(fā)熒光的現(xiàn)象對(duì)于研究斑節(jié)對(duì)蝦卵母細(xì)胞的發(fā)育具有重要意義。

該試驗(yàn)中使用的熒光顯微鏡3種熒光模塊（DAPI、GFP、RFP）分別能夠產(chǎn)生360、470和530 nm的激發(fā)光，分別激發(fā)產(chǎn)生447 nm的藍(lán)色熒光、525 nm的綠色熒光和593 nm的紅色熒光。3種激發(fā)光分別屬于熒光顯微鏡常用激發(fā)片組：360 nm的激發(fā)光屬于紫外光范圍（330～400），470 nm屬于藍(lán)色片組（420～485），530 nm屬于綠色激發(fā)片組（460～550）。斑節(jié)對(duì)蝦卵巢組織石蠟切片能夠被3種激發(fā)光激發(fā)，可能是因?yàn)樽园l(fā)熒光的物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)范圍較廣，根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果可

注：A～D：自發(fā)光;E～H：常規(guī)HE染色。

圖6 綠色熒光組織自發(fā)熒光與常規(guī)HE染色的效果比較（10×）