張旭升 朱平先 黃戰(zhàn)軍 蔡博治 張昕 張勇剛

摘要：目的在大鼠血管鈣化模型上，探討麝香保心丸對(duì)血管鈣化的影響及其可能作用機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分正常組、鈣化組及鈣化+麝香保心丸組，每組6只。鈣化組采用維生素D3（3×105 U/kg 1次，肌肉注射）和尼古丁（25 mg/kg溶于花生油中，早、晚各灌胃1次）誘導(dǎo)大鼠血管鈣化模型，鈣化+麝香保心丸組于造模后第2天開始，每天麝香保心丸灌胃[14.0 mg/（kg·d）]，用Von Kossa染色檢測(cè)血管鈣化程度，用鈣離子測(cè)試盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒測(cè)定大鼠主動(dòng)脈鈣含量和ALP活性，用放射免疫法檢測(cè)大鼠血漿單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）含量，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血管組織MCP1受體表達(dá)。結(jié)果維生素D3和尼古丁能夠誘導(dǎo)典型大鼠血管鈣化模型，Von Kossa染色可見血管鈣化模型大鼠主動(dòng)脈有大量黑色顆粒沉淀，鈣化組血管鈣含量、ALP活性高于正常組（P<0.01），同時(shí)，血漿MCP濃度、血管組織MCP1及其受體表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）;用麝香保心丸干預(yù)后，血管鈣化程度減輕（P<0.01）。血漿MCP1及其受體的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論麝香保心丸可抑制血管鈣化，并且提示可能通過下調(diào)MCP1表達(dá)和ALP活性抑制血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展過程。

關(guān)鍵詞：麝香保心丸;血管鈣化; 單核細(xì)胞趨化蛋白1;大鼠

中圖分類號(hào)：R288.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.019

文章編號(hào)：16721349（2015）01005203

Effect of Shexiang Baoxin Pill on Vascular Calcification in Model Rats

Zhang Xusheng，Zhu Pingxian， Huang Zhanjun，Cai Bozhi， Zhang Xin， Zhang Yonggang

Longgang District Peoples Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518172，Guangdong，China

Corresponding Author：Zhu Pingxian

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanism of Shexiang Baoxin Pill（SBP） in aorta of vascular calcification model rats.MethodsSevenweekold male SpragueDawley （SD） rats were randomly divided into normal group， calcification group and calcification plus SBP group （all n=6）.On the first day in calcification and calcification plus SBP group， vascular calcification was induced by a single dose intramuscular injection of vitamin D3 （300 000 U/kg） in the morning plus two doses of nicotine （25 mg/kg dissolved in peanut oil ） gavage in the morning and in evening.The next day after calcification induction， rats in SBP group were gavaged with SBP[14 mg/（kg·d）] for four weeks.Vascular calcification was confirmed by Von Kossa staining.Calcium content and alkaline phosphatases （ALP） activity were detected by calcium assay kit and ALP detection kit respectively.The contents of plasma monocyte chemotactic protein1 （MCP1） ?were determined by radioimmunoassay， and the expressions of corresponding receptors were determined by immunohistochemistry. ResultsVon Kossa staining showed that there were mass black granules deposited in aortic wall of the vascular calcified rats.Calcium content and ALP activity in calcified group were increased significantly than those in the control group （P<0.01）.Meanwhile， MCP1 contents in plasma and corresponding receptor level in calcified group were upregulated significantly compared with those in the control group（P<0.01）.In addition， SBP diet could reduce the degree of vascular calcium contents， ALP activity and MCP1 content.ConclusionSBP significantly protects the aorta against calcification partly through reducing MCP1 content and ALP activity.

Key words：Shexiang Baoxin pill;vascular calcification;monocyte chemotactic protein1;rat

血管鈣化是目前臨床上常見的病理表現(xiàn)，普遍存在于高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和慢性腎功能不全等疾病，亦存在于老年人生理性鈣化中，是導(dǎo)致心腦血管急性事件的重要危險(xiǎn)因子。國(guó)內(nèi)外研究表明，血管鈣化與生理性骨質(zhì)形成類似，是主動(dòng)的、可調(diào)節(jié)的過程[1]。目前證實(shí)許多活性因子如心血管組織分泌的活性因子（內(nèi)皮素、尾加壓素Ⅱ等）[2，3]和醛固酮[4]等都參與了血管鈣化的調(diào)節(jié)過程。本課題組近期發(fā)現(xiàn)[5]，炎癥因子參與血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展，然而，血管鈣化的機(jī)制非常復(fù)雜，具體機(jī)制尚未完全闡明，臨床上尋找防治血管鈣化的藥物，是當(dāng)前研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。研究表明，麝香保心丸具有抗炎、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用，在動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的治療發(fā)揮了很大的作用，但在血管鈣化方面的作用尚不清楚。本研究在維生素D3與尼古丁誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型上，用麝香保心丸干預(yù)，觀察血管鈣化指標(biāo)和單核細(xì)胞趨化蛋白1

（MCP1）的變化，探討麝香保心丸在血管鈣化中的作用和可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品無特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）20120001]，約7周齡，150 g～180 g。維生素D3購(gòu)自Sigma公司，尼古丁購(gòu)自Merck公司，純度>95%;堿性磷酸酶（ ALP）試劑盒、鈣離子測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;單核細(xì)胞趨化蛋白1試劑盒購(gòu)自北京華英生物研究所，MCP1受體一抗購(gòu)自北京博奧森，二抗即用型二步法（非生物素）檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋，DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德;麝香保心丸購(gòu)自上海和黃藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：12050401。其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2鈣化動(dòng)物模型制備參照文獻(xiàn)制備血管鈣化動(dòng)物模型[3]。雄性SD大鼠隨機(jī)分3組，每組6只。 正常對(duì)照組：大鼠第1天予等量生理鹽水肌注和單純花生油灌胃;鈣化組：第1天08：00予維生素D3肌肉注射（3×105 U/kg體重），尼古丁灌胃（25 mg/kg，溶于花生油），18：00尼古丁重復(fù)灌胃一次。鈣化+麝香保心丸組：模型制作同鈣化組，第二天開始予麝香保心丸胃灌[14 mg/（kg·d）]，1次/天。3組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，4周后稱重，3%水合氯醛麻醉，心臟取血，置入含有EDTA的試管中，4 ℃離心分離血漿，-80 ℃保存。摘取主動(dòng)脈，用冰生理鹽水沖洗后，部分石蠟包埋用于染色， -80℃儲(chǔ)存待測(cè)。

1.3Von Kossa染色取大鼠胸主動(dòng)脈段，石蠟包埋，制作4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、脫水。浸入1%硝酸銀溶液，在紫外線下照射30 min后，將切片置于5%硫代硫酸鈉溶液中1 min，0.25%堿性品紅返染。經(jīng)脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4血管組織ALP活性及鈣含量測(cè)定取腹主動(dòng)脈組織約40 mg，送南京建成生物工程研究所檢測(cè)，采用磷酸苯二鈉法測(cè)定ALP活性及甲基百里香酚藍(lán)比色法測(cè)定鈣含量。

1.5血漿MCP1含量測(cè)定取血漿約200 μL，置于0.5 mL EP管，送北京華英生物研究所檢測(cè)（放射免疫法）。

1.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)主動(dòng)脈組織中MCP1受體的表達(dá)采用4%多聚甲醛固定胸主動(dòng)脈，常規(guī)脫蠟至水、抗原修復(fù)、封閉非特異性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)軟件采用Graph Pad Prism 4進(jìn)行。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠主動(dòng)脈鈣化情況維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)后，用Von Kossa染色可觀察到主動(dòng)脈中膜彈性纖維間可見大量黑色顆粒沉積，表明大量鈣鹽沉積、典型血管鈣化形成，用麝香保心丸干預(yù)后，血管鈣化程度有所減輕。

2.2大鼠主動(dòng)脈組織鈣含量、堿性磷酸酶活性的變化鈣化組主動(dòng)脈組織鈣含量及堿性磷酸酶活性明顯高于正常組，用麝香保心丸干預(yù)后，主動(dòng)脈鈣含量和堿性磷酸酶活性有所下降。詳見表1。

2.3大鼠血漿、主動(dòng)脈組織MCP1受體的變化與正常組相比，兩組血漿MCP1及血管組織中MCP1受體的表達(dá)明顯上調(diào)，鈣化組最為明顯。詳見表2。

3討論

血管鈣化是一個(gè)主動(dòng)演變的過程，在某些病理情況下，如在氧化應(yīng)激、高鈣磷血癥、高血糖及高脂血癥等的刺激下，其中平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、外周細(xì)胞及間充質(zhì)祖細(xì)胞等向成骨樣表型細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是血管鈣化發(fā)生發(fā)展的重要核心。許多研究發(fā)現(xiàn)，維持血管穩(wěn)態(tài)的旁/自分泌因子參與血管鈣化的發(fā)生發(fā)展，如內(nèi)皮素1、血管緊張素Ⅱ[6]等可促進(jìn)血管鈣化。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，部分炎性因子（如CRP、IL6等）、血管活性肽（如尾加壓素Ⅱ等）及醛固酮等與血管鈣化密切相關(guān)。血管鈣化普遍存在于動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變及慢性腎病等疾病中，是心腦血管疾病高發(fā)病率和死亡率的重要因素之一，因此，臨床上防治血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展具有重要的意義。

麝香保心丸源于宋代經(jīng)典名方《太平惠民和劑局方》中的蘇合香丸，是芳香溫通類的代表藥物。最近研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸具有保護(hù)血管內(nèi)皮[7]、穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)斑塊[8]、抗炎[9]、促進(jìn)治療性血管新生及預(yù)防PCI后再狹窄[10，11]等作用，但在血管鈣化防治方面，尚無相關(guān)研究。為此，本研究在維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)大鼠血管鈣化模型上，用麝香保心丸干預(yù)，觀察血管鈣化程度的變化，并初步從炎癥方面探討相關(guān)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用維生素D3和尼古丁合用可誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈組織鈣含量增加，主動(dòng)脈中膜大量鈣沉積及鈣結(jié)節(jié)形成，形成典型血管鈣化，血管鈣含量和ALP活性亦同步上調(diào)，MCP1表達(dá)均高于正常組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。許多研究表明，炎癥因子參與許多心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，包括動(dòng)脈粥樣硬化等，如MCP1可使單核或巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞發(fā)生遷移并聚集，并激活炎癥細(xì)胞，產(chǎn)生白介素6、腫瘤壞死因子α等炎癥反應(yīng)介質(zhì)，從而構(gòu)成血管炎癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。本課題組亦發(fā)現(xiàn)炎癥因子與血管鈣化密切相關(guān)，鈣化組織炎癥細(xì)胞的聚集和炎癥因子表達(dá)的增加與血管鈣化密切相關(guān)。給予麝香保心丸干預(yù)后，血管鈣化的程度減輕，提示麝香保心丸可抑制血管鈣化的進(jìn)程。用麝香保心丸干預(yù)后，ALP活性和MCP1表達(dá)亦下調(diào)，提示麝香保心丸抑制血管鈣化的機(jī)制可能是通過下調(diào)MCP1的表達(dá)和ALP活性實(shí)現(xiàn)。由于植物提取物成分和有效成分作用靶點(diǎn)的復(fù)雜性，中藥成分對(duì)血管鈣化的藥理學(xué)作用尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可抑制血管鈣化，下調(diào)ALP活性及MCP1表達(dá)，其抑制血管鈣化的機(jī)制可能與通過下調(diào)ALP活性及MCP1表達(dá)等有關(guān)，這將為血管鈣化的機(jī)制研究及防治提供新的思路和作用靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sage AP，Tintut，Y，Demer LL.Regulatory mechanisms in vascular calcification [J].Nature Reviews Cardiology，2010，7（9）：528536.

[2]Wu SY，Zhang BH，Tang CS，et al.Endothelin1 is a potent regulator in vivo in vascular calcification and in vitro in calcification of vascular smooth muscle cells [J].Peptides，2003，24（8）：11491156.

[3]張勇剛，張旭升，魏睿宏，等.大鼠鈣化血管尾加壓素Ⅱ及其受體上調(diào)[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，18（7）：505509.

[4]黃戰(zhàn)軍，張旭升，周小歐，等.大鼠血管鈣化模型主動(dòng)脈醛固酮及其受體的表達(dá)[J].中華高血壓雜志，2012，20（11）：10351038.

[5]張旭升，周小歐，黃戰(zhàn)軍，等.大鼠血管鈣化模型炎癥因子及其受體的表達(dá)[J].嶺南心血管病雜志，2013，19（3）：341345.

[6]吳勝英，潘春水，劉秀華，等.內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ?qū)Υ笫笱茆}化的作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2004，20（11）：19611965.

[7]陸衛(wèi)紅，吳小慶，王強(qiáng)，等.麝香保心丸對(duì)冠心病患者血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（6）：845846.

[8]林惠珍，賈連旺.麝香保心丸對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17（8）：473475.

[9]Tian D，Ling S，Chen G et al.Hypertensive nephropathy treatment by heartprotecting musk pill：A study of antiinflammatory therapy for target organ damage of hypertension[J].Int J Gen Med，2011，15（4）：131139.

[10]葉子，李勇，施海明，等.麝香保心丸的小鼠含藥血清促雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)的研究[J].上海醫(yī)學(xué)，2006，29（5）：300302.

[11]車賢達(dá)，錢琳艷，高瑞蘭.麝香保心丸預(yù)防冠心病PCI術(shù)后再狹窄的臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（4）：765766.

（收稿日期：20140227）

（本文編輯王雅潔）