辛先祥 胡艷玲

【摘要】目的：驗(yàn)證前期研究發(fā)現(xiàn)的前列腺癌相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)rs1800477的功能。方法：選用前列腺癌LNCaP細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，針對(duì)位點(diǎn)rs1800477構(gòu)建慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染LNCap細(xì)胞，通過(guò)對(duì)LNCap進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，比較各組的遷移率，實(shí)驗(yàn)分為4組；空白對(duì)照組（CON）： 正常LNCap細(xì)胞未感染任何病毒的細(xì)胞組；陰性對(duì)照組（NC）：正常LNCap細(xì)胞加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組；野生型組（OE-wt）：正常LNCap細(xì)胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的細(xì)胞組；突變型組（OE-mu）：正常LNCap細(xì)胞加目的基因BEL2突變型病毒感染的細(xì)胞組。分別于6h和24h測(cè)量各組的細(xì)胞遷移距離并計(jì)算遷移率。結(jié)果：6h和24h時(shí)，野生型組和突變型組均出現(xiàn)差異，野生型組細(xì)胞遷移率分別為（0.24±0.02）%和（0.40±0.03）%，突變組細(xì)胞遷移率分別為（0.23±0.01）%和（0.41±0.03）%，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均<0.05），但野生型組與突變型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.454、0.618）。結(jié)論：前期研究發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)rs1800477對(duì)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的遷移能力無(wú)顯著影響。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌；LNCap；風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)；功能研究

【中圖分類號(hào)】R737.25 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）03-0092-01

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81272853和No. 81060213）

廣西醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新課題（No. YCSZ2014106）

前列腺癌在男性致死性疾病中排名第六，近20年前列腺癌全球內(nèi)的發(fā)病率逐年增加[1]。2008年的一項(xiàng)對(duì)年齡小于75歲的男性前列腺癌調(diào)查研究報(bào)道顯示，有903500名男性被確診為前列腺癌，其中258400人因前列腺癌導(dǎo)致死亡。前列腺癌不僅能在因原位器官引起癥狀，轉(zhuǎn)移到其他器官引起的病癥能帶來(lái)更大的痛苦，這不僅增加了家庭的負(fù)擔(dān)還給全社會(huì)造成了很大影響。越來(lái)越多的科學(xué)家試圖從基因水平揭露前列腺癌的發(fā)病機(jī)制。遺傳多態(tài)性是最常見的遺傳變異，但遺傳因素導(dǎo)致的癌癥的確切機(jī)制還沒(méi)有研究清楚。單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的研究表明位點(diǎn)突變通過(guò)與環(huán)境因素的相互作用引起相關(guān)癌癥的發(fā)生。位點(diǎn)的突變能夠引起相關(guān)氨基酸結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。在我們的前期研究[2]中發(fā)現(xiàn)位于BCL2基因的位點(diǎn)rs1800477通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與前列腺癌存在相關(guān)，在本研究中用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料

LNCaP細(xì)胞系由天津南開大學(xué)贈(zèng)送。Taq polymerase （SinoBio 批號(hào)E001-02B）， dNTP（Takara， 批號(hào)D4030A），胎牛血清（Gibco），REMI Medium 1640（Gibco），限制性內(nèi)切酶（NEB），BamHI/Agel酶切（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），GV166載體（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），positive clone測(cè)序（美季生物技術(shù)，型號(hào)ABI3730），PCR儀（Applied Biosystems， 美國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），細(xì)菌搖床（華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司，型號(hào)HI-92111K），37℃，Gilson移液器（吉爾森公司），5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（CEDCO）。

1.2 過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.1載體酶切： 基因信息：基因名稱為BCL2（NM-000633），物種為Human。載體信息：①載體名稱：GV166。②元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-IRES-puro。③克隆位點(diǎn)：BamHI / AgeI。酶切反應(yīng)體系：37℃，2h。試劑體積：ddH2O 42μL；10×buffer 5μL；純化的DNA質(zhì)粒（1g/L） 2μL；Agel（5U/μL）。

1.2.2 目的基因片段的獲取：引物交配堿基、酶切位點(diǎn)，并含有目的基因5端部分序列用于PCR釣取目的基因，具體序列為：BCL2-F：aggtcgactctagaggatcccgccaccatggcgcacgggagaac；

BCL2-R：agtccatggtggcgaccggctgtggcccgataggcac。

PCR反應(yīng)體系：ddH2O 12.4μL；5×Taq buffer 4μL；dNTPs（2.5mmol/L） 1.6μL；Primer（+）（10μmol/L） 0.4μL；Primer（-）（10μmol/L） 0.4μL；Template（10g/L） 1μL；Taq polymerase 0.2μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，∞ ；30cycle。

1.3 慢病毒的感染

⑴處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液。⑵將細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為5×104）接種于6孔板 中，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%。⑶根據(jù)公式：MOI 值=病毒量×滴度/感染細(xì)胞數(shù)，各組MOI值均為20，可計(jì)算出各組需要加入的病毒量（NC組滴度為（2E+9）TU/mL，病毒加入量2μL；OE-mu組與OE-wt組滴度均為（2E+8）TU/mL，病毒加入量20μL）。感染條件為1640+10%FBS+5 g/L polybrene。⑷12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)：如果有明顯的細(xì)胞毒性作用[5]，立即更換培養(yǎng)基；如果沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基。⑸感染3d后觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP 的表達(dá)情況。⑹感染9d后進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，整個(gè)過(guò)程記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變化。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和處理

用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，放置于37℃，5%CO2 的恒溫培養(yǎng)箱。為保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，細(xì)胞液隔天進(jìn)行更換。實(shí)驗(yàn)分為4組，（1） 空白對(duì)照組（CON）： 正常LNCap細(xì)胞未感染任何病毒的細(xì)胞組； （2） 陰性對(duì)照組（NC）：正常LNCap細(xì)胞加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組； （3） 野生型組（OE-wt）：正常LNCap細(xì)胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的細(xì)胞組； （4） 突變型組（OE-mu）：正常LNCap細(xì)胞加目的基因BEL2突變型病毒感染的細(xì)胞組。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為4組，往96孔板中加入約5X104個(gè)經(jīng)慢病毒感染后的LNCap細(xì)胞。第2天上午換無(wú)血清培養(yǎng)基，使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕漂洗2遍，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，拍照0h。放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)8～24h后取出，熒光顯微鏡拍照（以96孔中心陰影區(qū)域?yàn)閰⒄?，劃痕在圖片的正中）。在0，6，24h進(jìn)行圖像采集和細(xì)胞遷移距離的測(cè)量，將采集的圖像通過(guò)Image-Pro5.0軟件，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞未覆蓋的面積，并與0h時(shí)的無(wú)細(xì)胞區(qū)域面積比較以反映細(xì)胞的遷移率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6數(shù)據(jù)分析

資料存放于Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，每組均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)因此用計(jì)算平均遷移率。LSD-T檢驗(yàn)被用來(lái)比較兩組之間的差異。 若（P>0.05）認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 SPSS16.0被用來(lái)進(jìn)行LSD-T檢驗(yàn)和方差分析。遷移率計(jì)算公式：遷移率=（T0時(shí)面積-Tt時(shí)面積）/T0時(shí)面積×100%。

2 結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察

LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，在熒光顯微鏡（100×）下觀察和圖像采集，如圖1所示：可見CON組的細(xì)胞數(shù)明顯高于另外三組；NC組的細(xì)胞數(shù)略高于OE-wt和OE-mu組；OE-wt和OE-mu細(xì)胞數(shù)差別不大；四個(gè)組的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有區(qū)別，均生長(zhǎng)良好。以上結(jié)果可以表明rs1800477的突變對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的遷移無(wú)明顯作用。

2.2劃痕實(shí)驗(yàn)

在0小時(shí)，6小時(shí)和24小時(shí)分別測(cè)量并記錄了四組細(xì)胞均出現(xiàn)遷移變化（表1），并計(jì)算平均遷移率。遷移率比較（表2，3）顯示，在6小時(shí)突變型和野生型遷移率變化均出現(xiàn)差異，P值分別為0.009，0.036；24小時(shí)仍有顯著差異，P值分別為0.012，0.007。但野生型與突變型相比無(wú)顯著差異，6小時(shí)和24小時(shí)的P值分別為0.453，0.617，表明位點(diǎn)rs1800477對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移并無(wú)顯著影響。

表1. 四組細(xì)胞遷移距離信息表

時(shí)間 CON NC OE-WT OE-MU0 h 30.8 26.78 28.4 30.97 26.95 30.55 28.86 24.73 30.66 28.96 28.54 30.976 h 21.63 18.91 20.71

3 討論

前列腺癌發(fā)病率的逐年增高和轉(zhuǎn)移性已經(jīng)引起全球的廣泛關(guān)注。飲食習(xí)慣、種族、性行為方式、病毒感染等因素均能對(duì)前列腺癌的發(fā)病造成影響[3]。對(duì)前列腺癌的研究已經(jīng)不再局限于宏觀改善癥狀，現(xiàn)在的研究主要集中于從分子層面探索前列腺癌發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步找到預(yù)防和治療方法。LNCaP細(xì)胞系是從人類前列腺癌淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞中分離出來(lái)，保留了前列腺癌細(xì)胞的分化和增值特性[4]。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的前列腺癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，為我們的后續(xù)研究提供了豐富的資源，許多研究生人員進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性與前列腺癌關(guān)系的研究，并驗(yàn)證了相關(guān)位點(diǎn)與前列腺癌的相關(guān)性。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)位于NKX3.1上位點(diǎn)rs2228013的突變能夠增加前列腺癌的轉(zhuǎn)移[5]。另一項(xiàng)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)了位于CYP19A1的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)rs4775936，前列腺癌患者中突變型的生存時(shí)間比野生型的明顯縮短，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在DU145和PC3細(xì)胞系中驗(yàn)證。作為BCL2基因家族的一員，BCL2基因能夠通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞的程序性凋亡。RTK/ERK信號(hào)通路已經(jīng)被廣泛的證明與前列腺癌相關(guān)的重要通路，作為信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因BCL2能夠通過(guò)調(diào)控通路中相關(guān)基因的泛素化和磷酸化而影響基因的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。研究人員在DU145細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)BCL2表達(dá)程度的降低能夠選擇性降低ERK1/2，AKT信號(hào)通路的活性，并顯著降低腫瘤的發(fā)生率。

我們的研究位點(diǎn)rs1800477位于18號(hào)染色體，該位點(diǎn)尚未報(bào)道與癌癥相關(guān)。在一項(xiàng)對(duì)漢族人群的研究中發(fā)現(xiàn)rs1800477的突變能將原來(lái)編碼的丙氨酸變?yōu)樘K氨酸能導(dǎo)致男性少精。我們前期通過(guò)在中國(guó)前列腺癌協(xié)作組完成的全基因組掃描數(shù)據(jù)中進(jìn)行rs1800477進(jìn)行大樣本的關(guān)聯(lián)分析發(fā)下，該位點(diǎn)顯著與前列腺癌的發(fā)生存在相關(guān)性。但本研究在LNCaP細(xì)胞系的功能驗(yàn)證說(shuō)明rs1800477與前列腺癌無(wú)明顯相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)只在LNCaP一種細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證，有一定的局限性，臨床原始樣本基因組掃描發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，用于單一細(xì)胞系中驗(yàn)證，不能全面驗(yàn)證位點(diǎn)rs1800477與前列腺癌的關(guān)聯(lián)性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)欲在其他細(xì)胞系中進(jìn)行功能驗(yàn)證。

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