李新明 高忠東等

摘要

[目的]應(yīng)用3T3L1前脂肪細(xì)胞株，分析紅景天提取物（Rhodiola rosea L. herb extract， RRLHE）對3T3L1細(xì)胞增殖和分化的作用。[方法]使用油紅O染色法對紅景天提取物干預(yù)分化的細(xì)胞進(jìn)行評估并定量分析脂肪細(xì)胞分化程度。通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）來檢測脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因過氧化物體增殖劑活化受體γ（PPARγ）、CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）mRNA的表達(dá)。[結(jié)果]紅景天提取物能顯著抑制3T3L1細(xì)胞增殖和向成熟脂肪細(xì)胞分化，另外，紅景天提取物能顯著提高3T3L1前脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和利用率，紅景天提取物明顯抑制PPARγ、C/EBPα mRNA表達(dá)，與對照組比較，差異顯著（P<0.01）。[結(jié)論]紅景天提取物對3T3L1細(xì)胞增殖和分化均有抑制作用，并能提高3T3L1前脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和利用率，其影響機(jī)制與鈍化 PPARγ、C/EBPα mRNA 的表達(dá)有關(guān)系。

關(guān)鍵詞 紅景天提取物；3T3L1；細(xì)胞分化；PPARγ mRNA

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）05-025-02

Effects of Rhodiola rosea L. Herb Extract on 3T3L1 Proliferation and Differentiation

LI Xinming， GAO Zhongdong， LI Qun et al

（Processing Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan， Shanxi 030031）

Abstract [Objective] Preadipocyte 3T3L1 was used to evaluate the effect of Rhodiola rosea L. herb extract （RRLHE） on preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention. [Method] Oil red O staining method was used for evaluation of effect of Rhodiola rosea L. herb extract （RRLHE） on preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention. Adipocyte differentiation related genes expression， peroxisome proliferation activator receptor γ（PPARγ） and CAAT/enhancer binding protein α（C/EBPα） mRNA， were examined by using the reverse transcription polymerase chain reaction （Real time QPCR）. [Result] RRLHE could significantly inhibit preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention toward mature adipocytes. In addition， RRLHE could significantly increase 3H glucose uptake rate in preadipocyte 3T3L1. RRLHE could significantly inhibit PPARγ and C/EBPα mRNA expression compared to control group. [Conclusion] RRLHE can inhibit preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention toward mature adipocytes， enhance 3H glucose uptake rate in preadipocyte 3T3L1. The inhibitory effect has a relationship to deactivation of PPARγ and C/EBPα mRNA genes expression.

Key words Rhodiola rosea L. herb extract； 3T3L1； Cell differentiation； PPARγ mRNA

作者簡介

李新明（1970-），男，陜西西安人，副研究員，從事食品科學(xué)研究。

收稿日期 20141229

紅景天是景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）多年生草本或亞灌木植物。紅景天中含有多種化學(xué)成分，主要有黃酮類、酪醇、紅景天苷、谷甾醇、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖、脂肪、蛋白質(zhì)等，具有增強(qiáng)免疫功能，保護(hù)心腦血管等功效[1-2]。

筆者從與脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的2個因子過氧化物體增殖劑活化受體γ（peroxisome proliferator activated receptor PPARγ）和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CAAT/enhancer binding protein C/EBPα）入手，觀察了紅景天提取物對其mRNA表達(dá)的影響，為深入探討紅景天提取物改善脂代謝的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

紅景天提取物為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院制備。

3T3L1前脂肪細(xì)胞株購自American Type Culture Collection （ATCC）。其他試劑為Amresco公司產(chǎn)品或購自Sigma公司。

1.2 3T3L1前脂肪細(xì)胞的增殖及檢測

前脂肪細(xì)胞（3T3L1）分為對照組（不加藥）和藥物處理組。不同濃度前脂肪細(xì)胞（3T3L1）接種在96孔板上，參照XTT法描述，測定吸光度值（A570），建立細(xì)胞數(shù)目曲線。然后再將1.5×104/ml濃度的前脂肪細(xì)胞3T3L1接種于96孔板，每孔為100 μl培養(yǎng)基，在細(xì)胞貼壁后，加變化濃度的RRLHE（100、150、200 μg/ml）進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，分別檢測各組細(xì)胞的A570值，通過“A570值細(xì)胞數(shù)目”曲線計算每加藥24、48和72 h的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 紅景天提取物對前脂肪細(xì)胞3T3L1葡萄糖攝取率的影響

3T3L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后。將成熟的脂肪細(xì)胞以含0.2%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，分為4組：對照組（不加RRLHE）、低中高（100、150、200 μg/ml）劑量RRLHE處理組，藥物處理培養(yǎng)24 h。按文獻(xiàn)[3]所述方法測定3H葡萄糖攝取率。

1.4 3T3L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和定量檢測

將3T3L1前脂肪細(xì)胞按文獻(xiàn)[4]所述方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化8～12 d的3T3L1細(xì)胞85%以上呈脂肪細(xì)胞表型。

設(shè)置空白對照組（normal control，CON組）、紅景天提取物干預(yù)組[RRLHE組（100、150、200 μg/ml）]及羅格列酮干預(yù)組（ROS組），在培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的干預(yù)藥物。羅格列酮為10 μmol/L，CON組加等體積生理鹽水。分化液與藥同時加入，同步更換藥物與培養(yǎng)液。分化第8天開始油紅O染色，拍攝照片。異丙醇處理已染色的細(xì)胞，在細(xì)胞裂解后通過酶標(biāo)儀對脂滴著色程度進(jìn)行比色，檢測OD值（570 nm波長），定量分析細(xì)胞的分化程度。

1.5 實(shí)時定量PCR檢測PPARα和C/EBPα基因在3T3L1細(xì)胞中的表達(dá)

引物設(shè)計：PPARγ上游5′TTTCAAGGGTGCCAGTTT3′，下游5′AGGCCAGCATCGTGTAG3′，C/EBPα上游5′GGAAAGAAACGACTGGGAGC3′，下游5′CGACTAGACGCTATTGTGATT3′，GAPDH上游5′ATGAGGTCCACCACCCTG3′，下游5′TTGACCTCAACTACATGG3′；使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，通過寡脫氧核苷酸和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，采用Tag DNA多聚酶PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物，應(yīng)用ABIPRISM 7000序列檢測系統(tǒng)測定mRNA拷貝和循環(huán)數(shù)的線型關(guān)系，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。將正常對照組mRNA的表達(dá)量設(shè)為1，計算各組mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用（x±SD） 表示，并進(jìn)行組間差異比較，當(dāng)P<0.05時表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天提取物對前脂肪細(xì)胞3T3L1增殖的影響

在空白對照組，3T3L1前脂肪細(xì)胞數(shù)量在24、48、72 h呈倍數(shù)增長；與空白對照組比較，100、150、200 μg/ml RRLHE作用后（24、48、72 h），明顯抑制了脂肪細(xì)胞的增值，且有一定的劑量依賴關(guān)系（5.29±0.17、4.72±0.09、4.48±0.11 vs 5.35±0.12； 8.05±0.13、7.66±0.12、6.84±0.15 vs 8.79±0.07； 15.73±0.43、15.47±0.31、15.04±0.29 vs 16.05±0.34），即RRLHE濃度越高則抑制作用越明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1，P<0.05，P<0.01）。

油紅O脂肪特異性染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比較對照組，RRLHE處理組細(xì)胞內(nèi)亮紅色的脂滴顯著減少，充脂細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞體積也隨之降低，相比較對照組，羅格列酮處理組OD值也顯著增加，羅格列酮組分化成典型的成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞圓而大，胞內(nèi)充滿了脂滴。意味著高濃度RRLHE可顯著降低脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪的生成量，對3T3L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化具有顯著的抑制作用。

2.2 紅景天提取物對前脂肪細(xì)胞3T3L1 3H葡萄糖提取率的影響

紅景天提取物對前脂肪細(xì)胞3T3L1 3H葡萄糖攝取率的影響見圖1，與對照組相比較（Con組葡萄糖攝取率當(dāng)作參考對照基值（100%），其他藥物處理組分別與CK組相比較當(dāng)作各組的葡萄糖攝取率。），RRLHE處理組細(xì)胞內(nèi)3H葡萄糖攝取率隨藥物劑量的增加而顯著增加（108.8±2.6、117.6±4.1、122.1±3.5 vs 100±2.2），顯示出明顯的劑量依靠效應(yīng)。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 紅景天提取物對前脂肪細(xì)胞3T3L1中PRARγ和C/EBPα mRNA表達(dá)的影響

RRLHE對脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPα mRNA表達(dá)的影響見表2，RRLHE組PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA表達(dá)量顯著低于對照組（0.85±0.03 vs 1.00±0.1； 0.83±0.04 vs 1.00±0.1），與對照組相比，羅格列酮組的PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA表達(dá)量顯著增加（2.51±0.09 vs 1.00±0.1； 2.44±0.11 vs 1.00±0.1）（表2，P<0.01）。

3 討論

紅景天具有許多生物活性，如改善血液微循環(huán)、活血化瘀和緩解高原缺氧、促進(jìn)體脂和膽固醇代謝，減輕高脂血癥的作用。大量動物試驗已經(jīng)證明了紅景天提取物降低動物高脂血癥的效果[5]。紅景天提取物在臨床上廣泛應(yīng)用于高脂血癥的治療[6]。在目前的試驗中，紅景天提取物能夠降低3T3L1前脂肪細(xì)胞增殖和向成熟脂肪細(xì)胞分化，結(jié)果從細(xì)胞水平證明了紅景天提取物能夠調(diào)節(jié)脂代謝紊亂。另外，紅景天提取物處理能夠顯著增加前脂肪細(xì)胞3T3L1內(nèi)3H葡萄糖攝取率，這一效果隨藥物劑量的增加而增加，表明紅景天提取物在一定程度上能夠減輕胰島素抵抗效應(yīng)。這表明紅景天提取物可以提高葡萄糖攝取和利用，但不會增加體脂的聚積，從而不會引起體重的過度增加。

作為脂類代謝的重要調(diào)節(jié)因子，PPAR在調(diào)控能量代謝方面起重要作用，能夠調(diào)解脂肪酸吸收、脂肪沉積和形成、脂類代謝內(nèi)環(huán)境和胰島素抵抗[7]。在脂肪組織、小腸上皮細(xì)胞、骨骼肌和淋巴等多種器官及組織中，PPARγ廣泛表達(dá)[7]。C/EBPα屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中的脂肪形成?；罨腃/EBPα單獨(dú)能增加自身的表達(dá)，同時還能夠與PPARγ協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞分化[8]。該研究表明，紅景天提取物能夠抑制3T3L1前脂肪細(xì)胞中PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA的表達(dá)，這與羅格列酮的作用相反，推測紅景天提取物作為 PPAR 的配體，激活和活化了 PPAR 受體，提高了肝臟PPARγ mRNA、PPARα mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而啟動了下游與脂質(zhì)代謝有關(guān)酶的一系列基因轉(zhuǎn)錄，加速了脂肪氧化

分解，從而改善了脂質(zhì)代謝紊亂，這可能是紅景天提取物改

善脂質(zhì)代謝紊亂的作用機(jī)理之一。

推測紅景天提取物通過降低 PPARγ、C/EBPα mRNA 的表達(dá)來抑制脂肪細(xì)胞的分化，進(jìn)而抑制脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞內(nèi)的積聚和前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，增加葡萄糖的攝取和利用、抑制體脂的積聚，最終延緩體重的增加，從而其脂類和糖類代謝的改善作用。

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責(zé)任編輯 喬利利 責(zé)任校對 李巖