梁文涓等

摘要

[目的]制備降解牛糞纖維素的復合微生物菌劑。[方法]通過正交試驗，確定地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和放線菌屬4株菌的最優(yōu)配比，制成降解牛糞纖維素的復合微生物菌劑。[結果]復合微生物菌劑中HP2菌的所占比例為主要因素，各菌種最佳配合比例為TG1

∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1。[結論]該研究為復合微生物菌劑在牛糞堆肥中的應用提供了理論依據(jù)。

關鍵詞 復合微生物菌劑；牛糞纖維素；生長曲線；正交試驗

中圖分類號S811.6；Q939.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）21-243-02

我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時，畜禽糞便對環(huán)境的威脅成為一個不可忽視的問題。在減輕污染程度的基礎上最大程度地實現(xiàn)固體廢棄物資源化利用方式中，畜禽糞便的堆肥化處置是最佳的方式[1]。牛糞屬于冷性堆肥材料，其中纖維素占了很大的比例，因而牛糞較其他畜禽糞便難于分解。將微生物菌劑應用于牛糞堆肥，可以加速牛糞中纖維素的降解，縮短起溫時間，加快牛糞腐熟，提升堆肥質量。筆者研究了降解牛糞纖維素的復合微生物菌劑的制備，以期為進一步研究復合微生物菌劑在牛糞堆肥中的應用效果提供基礎材料和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1

菌種。前期研究中從腐熟牛糞與土壤中分離出HN1（枯草芽孢桿菌）、HP2（地衣芽孢桿菌）、TG1（放線菌）、P3（枯草芽孢桿菌）4株菌，用于復合菌劑制備。

1.1.2

儀器。主要儀器包括DPX650型恒溫培養(yǎng)箱、YJ875型超凈工作臺、BHG1型電熱恒溫干燥箱、HZQQ型搖床、628B型高壓蒸汽滅菌鍋、OLYPUS型顯微鏡、DT52型離心機、UV1100型紫外可見分光光度計。

1.1.3

培養(yǎng)基。羧甲基纖維素鈉液體發(fā)酵培養(yǎng)基：CMCNa 0.5%，蛋白胨0.3%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.4%，CaCl2 003%，MgSO4·7H2O 0.03%，Tween80 0.02%。豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖0.7%，豆餅粉0.4%，KH2PO4 0.03%，MgSO4 005%，F(xiàn)eCl3 0.03%，CaCO3 0.4%，酵母膏0.1%，pH=7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1

菌種活化。將P3、HP2、HN1接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基，TG1接種到高氏液體培養(yǎng)基中進行活化。活化條件：30 ℃下轉速為200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。

1.2.2

細菌和放線菌生長曲線測定。將活化的P3、HP2、HN1菌株接種到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，每隔1 h取發(fā)酵液1 ml稀釋，使OD值為0.1～0.6。每個發(fā)酵液樣品按相同倍數(shù)稀釋，分別測其OD值，直到20 h后細菌生長穩(wěn)定期開始。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制各菌株的生長曲線。

將活化的TG1菌株接種到豆餅粉液體培養(yǎng)基中，抽濾后稱干重，測定放線菌的生長曲線，每12 h測一次菌體干重。稱量時先將濾紙烘干再稱重，菌體放在已稱重的濾紙上抽濾，再將菌體與濾紙一起烘干后稱重，菌體干重即為兩次稱量的差值[2]。采用與P3相同的方法，繪制TG1菌株的生長曲線。根據(jù)菌種的生長曲線，確定最佳轉移接種時間。

1.2.3

復合微生物菌劑配比的確定。因牛糞粗纖維素含量高達32.5%，主要參考指標為纖維素酶活，將發(fā)酵好的菌液組合進行正交試驗（表1），確定各菌種之間的配合比例。測定相應的纖維素酶活，選擇最大纖維素酶活的菌種配比作為復合菌劑的最佳比例。

1.2.4

混合發(fā)酵液纖維素酶活的測定。將菌株分別接種于羧甲基纖維素鈉液體發(fā)酵培養(yǎng)基與豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)64 h后測定纖維素酶活。羧甲基纖維素（CMCase）酶活性測定依據(jù) 《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 202872006）[3]；濾紙（FPA）酶活性測定依據(jù)《微生物肥料生產(chǎn)菌株質量評價通用技術要求》（NY/T 18472010）[4]。

1.2.5

固體復合微生物菌劑的制備。將發(fā)酵好的菌液吸附于滅菌的稻殼粉中，每千克稻殼粉吸附600 ml發(fā)酵菌液，拌勻后風干。按照最佳配比混合拌勻后，測定混合發(fā)酵液纖維素酶活。

1.2.6

復合微生物菌劑的菌數(shù)測定。堆肥用的微生物菌劑應符合《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 202872006）的要求，對自制復合微生物菌劑采用平板計數(shù)法測定菌數(shù)。

2結果與分析

2.1 菌株最佳接種時間的確定

由圖1可知，P3在5 h之前生長滯后，菌體生長量不大；5 h之后進入了對數(shù)生長期，菌體開始大量繁殖；8 h之后進入了穩(wěn)定期，菌體不再大量生長，與環(huán)境形成了相對穩(wěn)定的狀態(tài)。8 h為P3對數(shù)生長期的末期，單個菌體的活性較強，且菌數(shù)也較高，所以第8小時為

P3的最佳轉移接種時間。同理，第9小時為HP2的最佳轉移接種時間，第8小時為HN1的最佳轉移接種時間，第96小時為P3的最佳轉移接種時間。

2.2 復合微生物菌劑配比的確定

由表2可知，TG1∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1時，纖維素酶活最大。各個因素的極差為：RA=0.664，RB=0.783，RC=1.130，RD=0.994，因此HP2所占比例為主要因素。由于正交試驗當中沒有此比例，所以單做TG1∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1的試驗，測定其纖維素酶活為6.91 U/ml，此值大于正交試驗的任何結果。

2.3 固體復合微生物菌劑的制備

按照最優(yōu)配比制得固體復合微生物菌劑，菌劑為暗黃色，帶有腥味。

2.4 復合微生物菌劑菌數(shù)測定

通過平板計數(shù)法，測得復合微生物菌劑中的微生物數(shù)目為3 cfu（108/g）>2 cfu，符合《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 202872006）的要求。

3 結論與討論

（1）試驗中細菌的生長停滯期較短，對數(shù)期來臨較早且持續(xù)時間短，一般12 h內便可完成細菌對數(shù)期的生長過程。放線菌的遲緩期較長，對數(shù)生長期來的晚，且持續(xù)時間長，增速也比細菌慢。

（2）在確定菌種轉移的時間時，試驗采取了對數(shù)期末、穩(wěn)定期前的時間，主要是由于此時單個微生物的生長速率較快，并且活菌數(shù)達到較大值。

（3）通過正交試驗確定復合微生物菌劑的配比，可以大大減少試驗的工作量。從各因素極差可以看出，HP2菌的所占比例為主導因素。最終正交試驗優(yōu)化結果顯示，各菌種最佳配比為TG1∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1。

參考文獻

[1]

章明奎.畜禽糞便資源化循環(huán)利用的模式和技術[J].資源與環(huán)境科學，2010（14）：280-283.

[2] 李天樞.畜糞堆肥高效復合微生物菌劑的研制與應用[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2013.

[3] 沈德龍，李俊，姜昕，等.GB 202872006，農(nóng)用微生物菌劑[S].北京：中國標準出版社，2006.

[4] 關大偉，陳慧君，李俊，等.NY/T 18472010，微生物肥料生產(chǎn)菌株質量評價通用技術要求[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.