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        腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Glu、NMDA—R1的影響

        2015-10-21 18:50:07杜培坤李妍怡王艷玲
        延邊醫(yī)學(xué) 2015年17期

        杜培坤 李妍怡 王艷玲

        摘要:目的:探討腦心通對(duì)缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。方法:采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)合鼠尾放血引起循環(huán)血量減少的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察大鼠腦組織中Glu含量及大鼠海馬組織NMDA-R1表達(dá)數(shù)量的變化。結(jié)果:腦心通組腦組織Glu含量明顯降低(P﹤0.01,與模型組相比),并且大鼠腦海馬組織內(nèi)NMDA-R1表達(dá)明顯減弱(P﹤0.01,與模型組相比)。結(jié)論:腦心通能夠減少腦缺血再灌注損傷后Glu的合成或釋放,抑制腦缺血再灌注損傷后NMDA-R的表達(dá),防止Glu對(duì)NMDA-R的過(guò)度激活,從而起到防止興奮性氨基酸毒性作用,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

        關(guān)鍵詞:腦心通;缺血再灌注;谷氨酸

        急性缺血性腦血管病是危害人類生命與健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病之一,具有較高的致死率、致殘率。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注能引起一系列病理和生化的變化,主要表現(xiàn)為腦組織能量代謝障礙、興奮性氨基酸(EAA)釋放增加、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、自由基產(chǎn)生、細(xì)胞腫脹和凋亡等[1,2]。本實(shí)驗(yàn)用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)合鼠尾放血引起循環(huán)血量減少的方法制備擬腦缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察腦心通膠囊對(duì)大鼠腦組織中Glu含量及大鼠海馬組織NMDA-R1表達(dá)數(shù)量的變化,探討其治療急性缺血性腦血管病的部分作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用中藥復(fù)方制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1實(shí)驗(yàn)主要材料

        選用四月齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠50只,體重300±20g,雌雄各半,由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。步長(zhǎng)腦心通膠囊; Glu試劑盒;NMDA-R1免疫組化試劑盒。

        2實(shí)驗(yàn)方法

        2.1動(dòng)物分組

        選取大鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)分為空白組10只和假手術(shù)組10只,余30只造模。采用卒中指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)選取20只造模成功的大鼠,隨機(jī)分模型組10只、步長(zhǎng)腦心通組10只。

        2.2模型制備

        采用由Nordtrom建立的2VO阻斷缺血模型,加鼠尾放血改良后用于本實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭苽鋄3]。要求術(shù)前禁食水。用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠,仰臥固定,被皮,消毒,沿頸正中線皮膚切口,再用神經(jīng)剝離器分離與頸總動(dòng)脈伴行的迷走神經(jīng),完全暴露出雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾閉頸總動(dòng)脈,阻斷血流10min,然后恢復(fù)血流,間隔10min,共2次。阻斷的同時(shí),剪鼠尾放血,以造成全腦低灌注,放血后熱凝止血,造成急性腦缺血再灌注損傷模型。

        假手術(shù)組:麻醉及手術(shù)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程與造模組操作過(guò)程大致相同,但不阻斷頸總動(dòng)脈亦不放血。

        2.3評(píng)價(jià)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)

        采用卒中指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]。卒中指數(shù)評(píng)分如下:毛發(fā)臟亂、顫抖各1分,運(yùn)動(dòng)減少或遲鈍1分,耳觸覺(jué)遲鈍為3分,眼固定狀睜開(kāi)為3分,后肢外展呈八字為3分,上瞼下垂為1分,轉(zhuǎn)圈為3分,驚厥或爆發(fā)運(yùn)動(dòng)為3分,極度虛弱為6分??偡?5分,﹥10分明顯有損傷。選取卒中指數(shù)﹥10分的動(dòng)物為造模成功的動(dòng)物。

        2.4 Glu、NMDA-R1的檢測(cè)

        采用比色法檢測(cè)腦組織中Glu的含量。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦海馬組織內(nèi)NMDA-R1免疫反應(yīng)細(xì)胞的表達(dá)。免疫組化SABC染色法,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片。切片中免疫組化顯色的神經(jīng)細(xì)胞定量,采用顯微鏡計(jì)數(shù)法。

        2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,多組均數(shù)間均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

        3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        3.1腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠卒中指數(shù)評(píng)分的影響

        表1顯示大鼠的卒中指數(shù)評(píng)分步長(zhǎng)腦心通組比模型組低,且隨時(shí)間推移呈遞減趨勢(shì)。第1天,步長(zhǎng)腦心通組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示腦缺血再灌注損傷模型制備成功,并且各用藥組動(dòng)物選取無(wú)差異;第6天,步長(zhǎng)腦心通組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第12天,步長(zhǎng)腦心通組與模型組比較組比較有顯著性差異,說(shuō)明步長(zhǎng)腦心通都能顯著改善模型大鼠神經(jīng)行為癥狀和體征,有較好療效,說(shuō)明中藥治療作用起效慢。

        3.2腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Glu含量的影響

        腦缺血再灌注后,與空白組、假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織Glu含量明顯升高,說(shuō)明模型組發(fā)生了明顯的興奮性氨基酸毒性作用;與模型組比較,腦心通組較模型組Glu含量均下降,有顯著差異,說(shuō)明腦心通可有效緩解腦缺血再灌注損傷后的EAA毒性作用。見(jiàn)表2。

        3.3腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦海馬組織NMDA-R1表達(dá)數(shù)量的影響

        腦缺血再灌注后,與空白組、假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦海馬組織內(nèi)NMDA-R1的表達(dá)數(shù)量均明顯低于空白組,說(shuō)明腦組織內(nèi)NMDA-R1在腦缺血再灌注過(guò)程中被激活,導(dǎo)致受體門(mén)控通道開(kāi)放,造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死;與模型組比較,步長(zhǎng)腦心通組NMDA-R1的表達(dá)數(shù)量明顯高于模型組,說(shuō)明步長(zhǎng)腦心通可以抑制腦缺血再灌注損傷后NMDA-R的表達(dá),保護(hù)及修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。見(jiàn)表3。

        4討論

        興奮性氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì),它們對(duì)缺血腦細(xì)胞具有興奮毒性作用,是缺血腦損害的重要環(huán)節(jié)。近年來(lái),引起神經(jīng)元死亡的興奮性氨基酸毒性理論已成為神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要學(xué)說(shuō)[5]。腦缺血再灌注損傷時(shí),突觸前神經(jīng)末梢和星型膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)量釋放Glu至細(xì)胞外,過(guò)度刺激Glu受體,特別是NMDA受體,引起神經(jīng)興奮性毒性作用,經(jīng)研究克隆出來(lái)的NMDA-R的亞型NMDA-R1是受體復(fù)合物的主要亞單位,具有NMDA-R的全部功能特點(diǎn)[6]。興奮性毒性作用不僅引起急性壞死,同時(shí)也啟動(dòng)遲發(fā)型壞死,還與缺血后炎癥反應(yīng)有關(guān)[7]。此外,Glu還可通過(guò)抑制細(xì)胞膜上的谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。胱氨酸在體內(nèi)還原成半胱氨酸(CYS),CYS又是谷胱甘肽(GSH)的合成原料及限速因素,當(dāng)胞外Glu過(guò)多時(shí)可抑制谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能,導(dǎo)致GSH合成減少,而GSH又是腦內(nèi)重要的活性氧清除劑,因此引起細(xì)胞內(nèi)氧自由基(如NO)堆積而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[8];NMDA受體的激活與線粒體形成活性氧自由基有關(guān);NMDA受體激活后可以破壞細(xì)胞內(nèi)外鉀離子的平衡從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,谷氨酸受體依賴型鈣通道和鈉通道同時(shí)向鉀離子開(kāi)放,因而暴露于NMDA的神經(jīng)元因細(xì)胞內(nèi)鉀離子降低可最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,其機(jī)制尚存爭(zhēng)議??赡艿臋C(jī)制有:1)細(xì)胞內(nèi)鉀離子低于正常只可激活Caspase-3而誘導(dǎo)凋亡[9]。2)鉀離子外流長(zhǎng)時(shí)程興奮性突觸后電位可激活細(xì)胞內(nèi)的鈣離子依賴性蛋白,降解酶等,使神經(jīng)元脂膜、細(xì)胞骨架蛋白、核酸等重要結(jié)構(gòu)解體。總之,EAA造成的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用主要包括三個(gè)方面:一是參與腦內(nèi)多種代謝過(guò)程,使三羧酸循環(huán)受阻,ATP生成減少,加重對(duì)細(xì)胞的毒性作用;二是缺血再灌注后介導(dǎo)的大量Na+及H2O的內(nèi)流,造成細(xì)胞毒性腦水腫;三是通過(guò)激活NMDA-R,介導(dǎo)Ca2+大量?jī)?nèi)流,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,激發(fā)一系列瀑布樣病理生理過(guò)程,進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。

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