余韶衛(wèi)等

摘要：目的：研究分析銀杏葉提取物對缺血再灌注肺損傷內(nèi)血紅素氧合酶的影響。方法：選擇實驗動物中心提供的60只健康小鼠，隨機性平均分成四組，分別為對照組、I/R組、GBE組、ZnPP-IX組。結(jié)果：各組間H0-1活性相比，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。GBE組MDA水平明顯低于I/R組、ZnPP-IX組，差異P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：銀杏葉提取物能夠誘導(dǎo)血紅素氧合酶的表達，對I/R肺損傷具有良好的保護作用。

關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物；缺血再灌注肺損傷；血紅素氧合酶；影響

肺移植后一般會出現(xiàn)缺血再灌注（即為I/R）損傷，以至于肺損傷造成移植后早期肺功能障礙、受體死亡。研究發(fā)現(xiàn)[1]，血紅素氧合酶1（簡稱HO-1）的高水平濃度是細(xì)胞拮抗氧化應(yīng)激損傷的一項關(guān)鍵的內(nèi)源性保護因子。銀杏葉提取物（簡稱GBE）能夠?qū)?xì)胞中的HO-1的表達進行誘導(dǎo)，促進HO-1的合成及分泌?，F(xiàn)針對肺 II 型細(xì)胞 I/R損傷試驗小鼠進行深入研究，觀察GBE對細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達是否有所影響及對I/R肺損傷是否存在保護作用，研究如下。

1材料與方法

1.1材料

銀杏特提取物（悅康藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格為5.0 ml：17.5 mg）。羅氏公司提供的COBAS 全自動生化分析儀，型號為INT EGRA400。H0-1免疫組化SABC試劑盒，由武漢博士德公司提供。其他試劑主要是分析純。選擇實驗動物中心提供的60只小鼠，體重為18-23 g，平均（20.54±1.48）g。

1.2方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞即為肺 II 型細(xì)胞株，對A549細(xì)胞進行復(fù)蘇，然后在DMEM 培養(yǎng)基上完成接種，其中含有100 lug/ml的鏈霉素、100 U/ml的青霉素、10%濃度的胎牛血清。放置在37攝氏度、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5.0%、飽和濕度環(huán)境下進行培養(yǎng)，等到細(xì)胞貼壁后在第二天更換液體。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底后[2]，應(yīng)用PBS 進行沖洗，用0.25%濃度的胰蛋白酶進行消化，離心時收集細(xì)胞以便傳代。

1.2.2制備肺 II 型細(xì)胞 I/R 模型

將A549細(xì)胞加入到甲右旋糖酐溶液（簡稱LPDG）內(nèi)，放置在40 C、100% O2的封閉箱內(nèi)培養(yǎng)12小時，模擬肺缺血。再更換成含有10%濃度的胎牛血清的DMEM，放置在37攝氏度、二氧化碳濃度為5.0%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時，然后模擬再灌注[3]。

1.3實驗分組

I/R組：A549細(xì)胞模擬缺血16小時，再灌注2小時。GBE組：應(yīng)用GBE預(yù)處理24小時候，缺血12小時，再灌注2小時。ZnPP-IX組：應(yīng)用GBE、Znpp-IX預(yù)處理24小時，缺血12小時，再灌注2小時。對照組：A549細(xì)胞進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞損傷指標(biāo)檢查

1.4.1檢查細(xì)胞存活率

在培養(yǎng)瓶中應(yīng)用胰蛋白酶對肺 II 型細(xì)胞進行消化，溶入0.5%濃度的臺盼蘭，3分鐘后，認(rèn)真計算藍染、沒有藍染的細(xì)胞計數(shù)，得出細(xì)胞存活率。

1.4.2檢查線粒體呼吸能力（英簡MR）

檢查前，先把每組培養(yǎng)液更換成含有5.0%濃度的胎牛血清DMEM，再加入 hanK 液對四氮甲基唑藍（簡稱MTT）進行溶解，最終濃度為0.5 mg/ml，放在37攝氏度環(huán)境中孵育1小時。認(rèn)真吸棄培養(yǎng)液，滴入100 ul的二甲基亞砜（簡稱DMSO），輕慢搖動混勻培養(yǎng)液，應(yīng)用450 nm的波長檢查其吸光度。對照組吸光度100%作為標(biāo)準(zhǔn)，計算其余三組吸光度的百分比情況，以此表示細(xì)胞線粒體呼吸的能力。

1.4.3細(xì)胞上清液 MDA水平

在低溫狀態(tài)下離心培養(yǎng)液，每分鐘1000 r，離心5分鐘，吸取上清液，MDA 水平應(yīng)用硫代巴比妥酸比色法進行檢測[4]。

1.4.4凋亡的檢查

收集2.0×106個肺 II 型細(xì)胞，進行離心沉淀，應(yīng)用3.0%濃度的戊二醛進行固定，然后通過電鏡檢測。同時，收集1.0×106個細(xì)胞，應(yīng)用PBS沖洗兩次，通過碘化丙啶（簡稱P1）與FITC-Annexin V雙染色后，使用流式細(xì)胞術(shù)凋亡率。

1.4.5 H0-1活性檢查

細(xì)胞經(jīng)5體積冷 TRis/Hcl 緩沖液進行離心，離心處理2次，分別是3.5 kg，20分鐘；0.8 kg，10分鐘，使線粒體沉淀。對上清液進行再次離心（105kg，90分鐘），致使微粒體分離。應(yīng)用100 mmol/L濃度、PH值7.4 的焦磷酸鈉將血紅蛋白除去，將磷酸鉀緩沖液制備成微粒體懸液。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行對比分析，對于計量資料，應(yīng)用方差±表示，并使用配對樣本t進行檢驗；對于計數(shù)資料，則用百分比（%）表示，然后利用X2進行檢驗。當(dāng)P值小于0.5時，說明試驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

各組間H0-1活性相比，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。GBE組MDA水平明顯低于I/R組、ZnPP-IX組，差異P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1.

3討論

肺部因為存在獨特性易損的組織結(jié)構(gòu)，對缺血引起的損害具有較高的敏感性，肺移植后一般會出現(xiàn)缺血再灌注（即為I/R）損傷，造成移植后早期肺功能障礙、受體死亡[6]。本次試驗通過模擬肺 II 型細(xì)胞I/R 損傷，在細(xì)胞、分子水平方面論證銀杏葉提取物（即為GBE）具有較強的抗 I/R 肺損傷功能，進一步了解銀杏葉提取物的作用途徑及對血紅素氧合酶含量的影響，進而為尋找新的抗肺移植 I/R 損傷及肺保護藥物提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

以往關(guān)于銀杏葉提取物的大量文獻表明，銀杏葉提取物存在松弛支氣管、消解平滑肌痙攣、促進循環(huán)、拮抗血小板活化因子（英簡PAF）、清除氧自由基等作用[7]。銀杏葉提取物是治療腦、腎、肺 I/R 損傷的一種天然中藥[8]，具有極大的研發(fā)潛質(zhì)。銀杏葉提取物的主要作用機制在于充分發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、清除氧自由基的作用，并且已經(jīng)有研究證實銀杏葉提取物能夠降低心腦器官的I/R 損傷。本次研究通過對健康小鼠模擬肺 I/R 損傷與常規(guī)培養(yǎng)、GBE預(yù)處理、GBE、Znpp-IX預(yù)處理三組小鼠進行對比試驗，提示增強HO-1的活性，對肺 I/R 損傷起到了良好的保護作用，可延長肺 I/R 小鼠的存活率。銀杏葉提取物可以有效誘導(dǎo)血紅素氧合酶的表達，并且血紅素氧合酶是已知存活在細(xì)胞微粒體內(nèi)的一種關(guān)鍵性能夠被誘導(dǎo)的抗氧化酶，同時也是細(xì)胞拮抗氧化應(yīng)激性損傷的一種標(biāo)志性內(nèi)源保護因子。通過上述試驗及結(jié)論可以推斷，銀杏葉提取物能夠誘導(dǎo)血紅素氧合酶的表達，對 I/R 肺損傷具有良好的保護作用。

參考文獻：

[1]夏安周，邢淑華.銀杏葉提取物對缺血再灌注損傷的保護作用研究進展[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，23（4）：369-370.

[2]王雁，楊義芳.銀杏葉的藥理作用及其機制的研究進展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2011，18（1）：1-3.

[3]周蘭蘭，明亮，左從文，等.銀杏葉提取物改善反復(fù)腦缺血再灌注小鼠血液流變學(xué)的作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2012，17（2）：91-93.

[4]李玲，郭澤云，，吳春云，等.銀杏葉提取物對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的影響[J].中國新藥與臨床雜志，2011，20（3）：171-172.

[5]郭瀟.銀杏達莫對兔心肌缺血再灌注誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機制[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，19（5）：F003-F004.

[6]Akgui T ， Karaguzel E， Surer H ， et al .Ginkgo biloba （ EGB761）affects apoptosis and nitric-oxide synthases in tes-ticular torsion： an experimental study [J] . Int Urol Nephrol，2009，41（3）：531-536.

[7]Mechirova E ， Domorakova I， Dankova M ， et al . Effect of no-radrenalin and EGb 761 pretreatment on the ischemia-reperfu-sion injured spinal cord neurons in rabbits[ J] . Cell Mol Neuro-biol， 2009， 29（ 6-7） ： 991 -998.

[8]謝守霞，張萬帆，賈孟良，等.基因芯片分析銀杏葉提取物對小鼠腎缺血-再灌注損傷的保護作用機制[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，26（12）：1455-1459.