賈瑞 吳坤鑫 王穎 賈賢 陳雄庭

摘 要 以橡膠草的根部作為外植體進行組織培養(yǎng)和快速繁殖研究。結(jié)果表明：橡膠草根部外植體防止褐化的最佳方法為MS+500 mg/L AC預(yù)培養(yǎng)3 d；根部愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+0.6 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L 2，4-D，平均誘導(dǎo)率為90%；分化培養(yǎng)基為MS+0.8 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞 橡膠草；愈傷組織；再生體系

中圖分類號 S567 文獻標(biāo)識碼 A

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）， 是菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum）的多年生草本植物。橡膠草具有較強的生長繁殖能力，能夠生長在較寒冷的地區(qū)，產(chǎn)生優(yōu)良種子，極容易種植，并且具有較強抗菌能力和抗蟲害能力。橡膠草外形與蒲公英非常相似，但根部可以分泌與巴西橡膠樹成分相當(dāng)?shù)膬?yōu)良天然橡膠，其干重約占根部成分的20%[1-2]，在工業(yè)上有重要的利用價值，可為緩解我國橡膠產(chǎn)業(yè)不足，依賴進口的現(xiàn)狀提供支持。橡膠草的生長較巴西橡膠樹而言，適宜栽培的地區(qū)廣，適應(yīng)性強，生長速度快，在我國華東、華北、東北和西北等地區(qū)均適宜進行橡膠草的種植，是極具經(jīng)濟發(fā)展前途的產(chǎn)膠植物[3]。

目前國外學(xué)者對橡膠草的研究從形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織生理、栽培技術(shù)等方面轉(zhuǎn)向?qū)ο鹉z草的產(chǎn)膠蛋白顆粒及相關(guān)的酶進行分子生物學(xué)研究[4-6]，而國內(nèi)學(xué)者也開始從形態(tài)學(xué)方面研究逐漸向分子遺傳轉(zhuǎn)化方向發(fā)展，并已通過葉片作為外植體，初步開展了橡膠草再生體系的研究[7-9]。但由于目前再生體系并不夠成熟，發(fā)展進度較為緩慢。本文以橡膠草根部為材料進行愈傷組織的誘導(dǎo)、分化以及生根的研究，為橡膠草組培快繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所橡膠樹細胞工程研究室種子繁殖的試管苗為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 以MS為基本培養(yǎng)基，添加3 g/L蔗糖和5 g/L瓊脂粉，根據(jù)試驗設(shè)計，在不同培養(yǎng)階段附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，pH調(diào)至（5.8±0.1），121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，分裝于組培瓶或培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 材料的處理 將保存于培養(yǎng)箱內(nèi)的橡膠草試管苗進行生根培養(yǎng)，待根長達5 cm以上時，將根切成長約1.5～2 cm的小段備用。

1.2.3 外植體的的預(yù)培養(yǎng) 在MS基本培養(yǎng)基中分別加入活性炭300、500、700 mg/L，并以不添加活性炭MS作為對照。每個處理接種到5個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種5個外植體，3次重復(fù)，（23±2）℃進行暗培養(yǎng)，3、7、10 d后分別對其進行觀察統(tǒng)計。褐化率（%）=外植體褐化數(shù)/接種外植體數(shù)，死亡率（%）=外植體死亡數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗要求附加不同濃度的2，4-D和6-BA，每個處理接種5個培養(yǎng)皿，每個皿接種5個外植體，3次重復(fù)。在光照周期為14 h/d，溫度為（23±2）℃，光照強度為1 800～2 000 lx的條件下培養(yǎng)，7 d后對其進行觀察統(tǒng)計。愈傷組織的誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.2.5 誘導(dǎo)愈傷組織分化 將綠色、顆粒狀、質(zhì)地堅硬的愈傷組織接種于附加不同濃度NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基上，每個處理接種5個培養(yǎng)瓶，每瓶接種3個外植體，3次重復(fù)。在光照周期為14 h/d，溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 000 lx的條件下培養(yǎng)，7 d后對其進行觀察，14 d后對其進行統(tǒng)計。誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生分化的愈傷組織數(shù)目/接種愈傷組織的數(shù)目。

1.2.6 生根培養(yǎng) 待苗長到3 cm左右的時候轉(zhuǎn)入的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根的產(chǎn)生。在光照周期為14 h/d，溫度為（25±2）℃，光照強度為1 800～2 000 lx的條件下培養(yǎng)，14 d后對其進行觀察統(tǒng)計。生根率（%）=生根苗數(shù)/總的接種苗數(shù)。

1.2.7 煉苗與移栽 將株高5 cm以上，根長5 cm左右的橡膠草組培苗進行煉苗移栽，移栽前先將組培苗的瓶蓋打開一半放置于陰涼的地方3 d后，將幼苗基部的瓊脂洗凈，用0.1%的多菌靈浸泡30 min，然后將其移栽到小盆中，移栽基質(zhì)為營養(yǎng)土 ∶ 砂石 ∶ 蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1的混合基質(zhì)。移栽后先將苗放置于光照強度為1 800～2 000 lx的培養(yǎng)箱預(yù)煉苗7 d，然后再將其完全暴露于自然的環(huán)境下。

1.3 數(shù)據(jù)分析

該試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。試驗中所獲得的各處理數(shù)據(jù)均先進行方差分析，在p﹤0.05水平上，采用LSD法做多重比較[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度活性炭和處理時間對外植體褐化率和死亡率的影響

由表1可知，在未添加活性炭的培養(yǎng)基中，接種3 d，外植體切口開始出現(xiàn)褐化（圖1-A），接種7 d后整個外植體褐化，隨后死亡（圖1-B），在培養(yǎng)基中添加500 mg/L的活性炭，外植體接種7 d后，只有少數(shù)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，抑制褐化的效果好，且對外植體的傷害最小（圖1-C）。但當(dāng)活性炭濃度增加到700 mg/L，接種7 d后，褐化雖然得到一定程度的抑制，但外植體開始變黃，隨后慢慢死亡（圖1-D），說明活性炭的吸附作用沒有選擇性，在吸附有毒物質(zhì)的同時也吸收培養(yǎng)基里的營養(yǎng)元素，從而導(dǎo)致外植體的死亡。在相同活性炭濃度的不同組合中，褐化率和死亡率總體上隨著時間的增加而增加。從褐化率的多重比較結(jié)果可知，處理7、8、9、10之間差異不顯著，且極顯著的低于其他處理組，其中處理7、10均值最低，且都為0.00%，但處理10逐漸出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，從節(jié)約成本和時間的因素考慮，選擇處理7作為抑制外植體褐化現(xiàn)象的最佳處理。從死亡率的多重比較結(jié)果可知處理7、8、9、10之間無顯著差異，且極顯著的低于其他處理組，其中處理7、8、10均值最低都為0.00%，但處理10逐漸出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，綜合考慮，選擇處理7作為抑制外植體褐化現(xiàn)象的最佳處理。故根部作為外植體時，選擇處理7作為抑制外植體褐化現(xiàn)象和死亡現(xiàn)象的最佳處理，即MS+500 mg/L AC預(yù)處理3 d。

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