楊明星 申磊 文嘉瑜 唐倩 石蘭平 劉艷艷 楊晟 胡炯 劉彩玲 吳楊 何水林

摘 要 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在植物生長、發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境中起著十分重要的作用，但對該家族多數(shù)成員的表達調(diào)控機制認識仍十分有限。前期實驗已分離獲得辣椒一個MAPK家族成員CaMAPK7，并發(fā)現(xiàn)該基因的表達受病原菌、高溫等逆境的誘導(dǎo)，但其表達調(diào)控機制仍不清楚。本研究進一步分離了CaMAPK7的啟動子序列（pCaMAPK7），發(fā)現(xiàn)其TATA框位于-165 bp與-170 bp之間，此外還發(fā)現(xiàn)W-box，HSE，TCA，LTR，ERE等多種與生物及非生物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。通過構(gòu)建該啟動子與報告基因GUS融合表達載體pCaMAPK7：：GUS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草葉片瞬間表達系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)pCaMAPK7可應(yīng)答青枯菌接種及水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、油菜素內(nèi)酯（BR）、脫落酸（ABA）和乙烯（ET）等外源激素處理，表明CaMAPK7應(yīng)答青枯菌、外源激素處理主要是通過該啟動子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 辣椒；啟動子；煙草瞬間表達系統(tǒng)

中圖分類號 S641 文獻標識碼 A

MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）聯(lián)結(jié)一般由MAPKKK、MAPKK 和MAPK組成，廣泛存在于真核生物中，參與介導(dǎo)細胞的生長、發(fā)育、分裂、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)，并與生長素、脫落酸、乙烯和細胞分裂素等信號通路有關(guān)，在植物生長、發(fā)育和適應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫的信號傳導(dǎo)中起重要的調(diào)節(jié)作用，但其表達調(diào)節(jié)和作用機制仍不清楚。

擬南芥[1]、小麥[2]、水稻[3]、辣椒[4]和短柄草[5]等大量的植物或作物基因組測序的完成和公布，為植物MAPK信號聯(lián)結(jié)成員的鑒定、表達調(diào)節(jié)和功能分析奠定了重要的基礎(chǔ)。已經(jīng)在多種植物基因組中發(fā)現(xiàn)20個左右的MAPK成員，并對部分成員的表達和功能及其作用機制進行了分析。例如，研究表明棉花GhMPK2可以受到病原菌侵染的誘導(dǎo)表達并且其在煙草超表達可以明顯提高轉(zhuǎn)基因煙草對病原菌的抗性[6]，GhMPK17在棉花應(yīng)答高鹽中起著重要的作用[7]，水稻MAPK家族成員IBR5在水稻耐干旱中起著負調(diào)控的作用[8]，這些結(jié)果表明MAPK通路在植物適應(yīng)各類逆境脅迫過程中起著重要作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)辣椒基因組中CaMAPK7在根、莖和葉中均有不同程度的組成型表達，其中以根部的表達最高，這種組成型表達可能與該基因參與植物的生長發(fā)育有關(guān)，另外，在葉片中則受到青枯菌侵染、高溫等逆境及水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯等外源激素處理的誘導(dǎo)，但脫落酸處理使其表達下調(diào)，暗示CaMAPK7可能在辣椒應(yīng)答青枯病和高溫等逆境脅迫中起一定作用[9]，但其應(yīng)答逆境或外源激素表達的分子機制還不太清楚。本研究利用GUS報告基因分析啟動子在生物與非生物逆境處理下的轉(zhuǎn)錄表達情況，不僅有利于闡明CaMAPK7應(yīng)答幾種外源激素的分子機制，為進一步鑒定CaMAPK7功能奠定基礎(chǔ)，還可望為作物的遺傳改良提供有利用價值的誘導(dǎo)型啟動子或者順式作用元件。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒基因型CM334、本氏煙草、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH10B、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、Gateway入門載體pDNOR-207及GUS融合載體pMDC163均由本實驗室提供。KOD高保真聚合酶購自北京百奧萊博科技有限公司，Gateway試劑盒購自Invitrogen公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自泰京有限公司，各種抗生素購自上海生工生物有限公司，引物合成和測序均委托上海Invitrogen公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CaMAPK7啟動子的克隆 利用CTAB法提取的辣椒CM334基因組DNA為模板，利用premier primer 5.0生物信息學(xué)軟件設(shè)計用于擴增該啟動子的上下游引物（F5′-GGGGACAAGTTTGTA

CAAAAAAGCAGGCTTCACCAATTTAAATAATGTAA

TAGAAA-3′R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA

GCTGGGTCTTCTCTGTTATTTTCAATATTCA-3′），采用KOD高保真酶進行PCR反應(yīng)（程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；68 ℃，90 s，30 cycles，68 ℃，10 min），用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行回收。

1.2.2 CaMAPK7啟動子轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建 用Gateway法的BP反應(yīng)將PCR產(chǎn)物連接到入門載體pDNOR-207，命名為pCaMAPK7-207，挑取經(jīng)PCR驗證的陽性克隆送往英俊生物公司進行測序，測序確認無誤后使用Gateway的LR反應(yīng)構(gòu)建pCaMAPK7：：GUS目的表達載體，并命名為pCaMAPK7-163。PCR檢測為陽性的再使用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對CaMAPK7啟動子序列進行順式作用元件分析 把公司發(fā)回的測序結(jié)果與GenBank公布的辣椒（CM334）的啟動子序列在DNAMAN上進行比對，確定兩者之間的同源序列，比對結(jié)果無誤之后在PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上對獲得的啟動子序列進行順式作用元件分析。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬間表達 將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在含75 μg/mL抗生素利福平、50 μg/mL卡那霉素和0.2 μg/mL LB固體（10 g Tryptone，5 g Yeast extract，10 g NaCl，15 g agar/L），培養(yǎng)基上劃線，28 ℃下培養(yǎng)2 d。挑取單克隆接種于2 mL含有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃下以220 r/min震蕩培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)移至50 mL新鮮配制不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，3 500 r/min離心15 min并收集菌液，用侵染液（10 mmol/L MgCl2，

10 mmol/L MES，200 mmol/L acetosyringone，pH5.1～5.4）重懸，終濃度為OD600=0.6～0.8。用不帶針頭的針管將菌液注射進事先用水拭擦干凈的生長健康且均勻一致的本氏煙草葉片中。將注射完滲透液的煙草移至25 ℃光照培養(yǎng)箱中（L ∶ D=16 h ∶ 8 h）。培養(yǎng)2 d后對煙草進行各種逆境處理。

1.2.5 煙草植株的幾種逆境處理 煙草植株的煙草青枯菌（R. solanacearum）接種：首先將-80 ℃保存的青枯菌FJC100301于4 ℃下溶化并在含有TTC的SPA固體培養(yǎng)基中劃線，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，從SPA固體培養(yǎng)基中挑取單克隆接種于100 mL SPA液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床震蕩約24 h，搖至菌液OD600值達到1.0。菌液在3 500 r/min下離心10 min，去除上清，用10 mmol/L MgCl2重懸至終濃度為OD600=0.6，接著把調(diào)好OD600值的懸浮液用去掉針頭的注射器針筒注射先前已滲入含啟動子滲透液的各個煙草葉片中，同時以注射MgCl2的煙草葉片作為對照。處理后的煙草放回光照培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)12 h和24 h后，分別采樣做GUS酶活性的測定。

煙草植株外源激素處理：對先前已注射啟動子滲透液的本氏煙草葉片分別進行外源激素處理。具體方法是將茉莉酸甲酯100 μmol/L、水楊酸1 mmol/L、脫落酸100 μmol/L、乙烯100 μmol/L和油菜素內(nèi)酯10 μmol/L直接噴灑在已注射含啟動子滲透液的煙草葉片并保濕，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中（L ∶ D=16 h ∶ 8 h）處理12 h和24 h后分別采樣提取蛋白用于GUS定量分析，同時設(shè)置噴灑蒸餾水為對照。所有的處理均做6個重復(fù)。

1.2.6 CaMAPK7啟動子酶活性的測定 GUS酶活性的測定采用分光光度計法進行，具體步驟參考曾凡鎖[10]等的方法。酶活力單位為每分鐘水解PNPG生成1 nmol/L對硝基苯酚的酶量為一個單位。GUS活性以每mg蛋白的酶活力表示，實驗設(shè)置6次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaMAPK7基因的啟動子克隆及序列分析

通過PCR反應(yīng)擴增出一條大小約為1 500的PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物連接到入門載體pDNOR-207并測序，得到的測序序列與Genbank公布的辣椒CM334該啟動子序列比對，在順式作用元件分析網(wǎng)站plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對獲得的序列進行分析，預(yù)測到多個與植物逆境相關(guān)元件，如高溫相關(guān)元件HSE、WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件W-box、乙烯應(yīng)答元件ERE、低溫應(yīng)答元件LTR等（圖1）。

2.2 啟動子GUS融合載體的構(gòu)建

通過特異性引物PCR的擴增，獲得了CaMAPK7啟動子PCR擴增片段（pCaMAPK7）（圖2），將該片段通過Gateway技術(shù)通過過渡載體pDONR-207進一步克隆到目的載體pMDC163中并驗證（圖3），最后將含pCaMAPK7：：GUS 的目的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101并驗證（圖4），最終構(gòu)建的融合表達載體（圖5）。

2.3 啟動子不同逆境和激素處理下的表達分析

在ABA、BR、ET、JA激素處理下，12 h和24 h時，GUS活性都出現(xiàn)了極顯著性差異（p<0.01），在12 h，分別為對照的3.53、2.12、3.55、3.37倍；在24 h，分別為對照的4.37、4.48、3.74、3.48倍；而在SA處理下，在12 h出現(xiàn)極顯著性差異，為對照的4.9倍，隨后在24 h又恢復(fù)到與對照沒有顯著差異；在接種青枯病處理后，在12 h出現(xiàn)極顯著性差異，為對照的2.63倍，24 h則有顯著性差異（p<0.05），為對照的2.56倍。在ABA、BR、ET、JA、SA和青枯菌接種處理下，pCaMAPK7驅(qū)動的GUS活性都出現(xiàn)不同程度的增強（圖6）。這些結(jié)果說明CaMAPK7啟動子能夠響應(yīng)青枯菌和多種外源激素處理。

3 討論與結(jié)論

植物在其自然生境中總是不可避免地遭受到各種生物和非生物逆境脅迫，長期的進化也使植物形成了復(fù)雜的防御反應(yīng)機制，包括對各種逆境的感知和信號傳遞，最終達到細胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達以實現(xiàn)在生理生化水平上應(yīng)對逆境的調(diào)節(jié)。植物的耐（抗）逆反應(yīng)在很大程度上受到信號通路的調(diào)控，其中MAPKKK-MAPKK-MAPK級聯(lián)是植物應(yīng)答逆境信號通路的重要組成成員，均由多基因家族編碼。大量研究表明，參與應(yīng)答逆境的植物MAPK家族成員往往表現(xiàn)出對逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒CaMAPK7的啟動子區(qū)域中含有5個W-box、1個HSE、1個LTR和1個TCA等與生物以及非生物脅迫相關(guān)的順式作用元。其中W-box是可和特定WRKY轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子的不同成員可參與包括病害、高溫、干旱、高鹽等，還與SA、JA、ET等信號通路相關(guān)[11-16]。LTR元件是與低溫脅迫相關(guān)的元件[17-21]。ERE元件是一個與乙烯應(yīng)答相關(guān)的元件[22]。HSE則可通過與HSF結(jié)合，介導(dǎo)目標基因?qū)Ω邷孛{迫的應(yīng)答[23]。TCA在目標基因應(yīng)答外源SA處理中起作用[24]。這些原件的存在與本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)該基因可受到青枯菌接種和高溫處理的誘導(dǎo)結(jié)合較為吻合?；谵r(nóng)桿菌注射的煙草外源基因瞬間表達分析方法已經(jīng)在植物功能基因組學(xué)研究中得到了成功的應(yīng)用[25]。本研究利用該方法分析了pCaMAPK7：：GUS中GUS報告基因?qū)η嗫菥臃N以及外源激素處理的應(yīng)答，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCaMAPK7驅(qū)動的GUS基因表達受到青枯菌接種和外源SA，JA，ET，BR 和ABA等激素處理的誘導(dǎo)，進一步表明CaMAPK7應(yīng)答青枯菌接種和各種外源激素處理與其啟動子順式作用原件結(jié)合特地的轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)所致。由于pCaMAPK7可協(xié)同應(yīng)答SA，JA，ET，BR 和ABA等外源激素處理，暗示CaMAPK7可能參與了上述激素介導(dǎo)的信號通路，在辣椒耐高溫和抗病等反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。未來進一步分離CaMAPK7的底物，將有助于進一步 解析CaMAPK7的作用辣椒的抗逆機制。

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