馬智玲 李凌云 劉新艷 魏長賓 劉玉革 劉肅 方佳

摘 要 應用分散固相萃?。―SPE）與分散液液微萃取（DLLME）相結合的樣品前處理技術，與氣相色譜-飛行時間質譜（GC-TOF/MS）聯(lián)用，建立了同時快速篩查桃中25種農(nóng)藥殘留的分析方法，實驗考察了2種萃取方法中影響凈化和萃取效率的各個因素，并建立了飛行時間質譜農(nóng)藥篩查數(shù)據(jù)庫。結果表明：在優(yōu)化的實驗條件下，25種農(nóng)藥在一定的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)（r）均大于0.98；桃空白基質在10、30、50 μg/kg 3個不同的添加濃度下，農(nóng)藥的平均回收率為64.9%～119.8%，相對標準偏差（RSD）為3.5%～22.1%，方法的檢出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10）范圍分別為0.01～12.30 μg/kg和0.1～36.7 μg/kg。

關鍵詞 桃；農(nóng)藥多殘留；DSPE；DLLME；GC-TOF/MS

中圖分類號 S481+.8 文獻標識碼 A

近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們的食品安全意識越來越強，在強調(diào)水果優(yōu)質營養(yǎng)的同時，對安全也提出了更高的要求。由于桃在生長的過程中伴隨多種病蟲害的發(fā)生，往往需要通過使用殺蟲劑、殺菌劑、殺螨劑等多類農(nóng)藥進行綜合防治，加上不合理使用農(nóng)藥的現(xiàn)象嚴重，很容易導致農(nóng)藥多殘留的發(fā)生，造成對人體健康的危害和對環(huán)境的污染[1-3]。只有通過快速準確的多農(nóng)藥殘留篩查檢測方法，及時了解桃中的農(nóng)藥殘留狀況，才能夠指導實際的監(jiān)管、生產(chǎn)及消費，最終保證消費者的安全[4]。

已報道的桃中多農(nóng)藥殘留的樣品前處理方法包括傳統(tǒng)的液液萃取法、固相萃取等，但上述方法的不足之處在于分析時間長、有機溶劑用量大、富集倍數(shù)低等[5-6]。近年來，已發(fā)展了多種新型的樣品前處理技術，如固相微萃取、液相微萃取等，其最大的優(yōu)點就是不需要溶劑或是有毒溶劑的使用量達到微升級，適應了當前綠色化學發(fā)展的需要[7-8]。分散液液微萃?。―LLME）是利用微量的萃取劑實現(xiàn)對目標物的高度濃縮，具有操作簡單、快速、成本低、有機溶劑用量少、萃取時間短、富集效率高等優(yōu)點，已被廣泛應用于多種農(nóng)藥殘留的檢測，然而因其凈化程度較低，難以實現(xiàn)對復雜固體基質中目標物的分析[9-11]。分散固相萃取技術（DSPE）是利用分散的凈化劑實現(xiàn)對復雜基質的、快速凈化，但其富集倍數(shù)較低[12]。有文獻報道稱使用DSPE與DLLME聯(lián)用的樣品前處理技術可有效解決二者存在的問題[13]。水果中的多農(nóng)藥殘留檢測主要采用色譜-質譜聯(lián)用法，大多采用四級桿、離子阱等多級質譜，隨著質譜技術的發(fā)展，高分辨飛行時間質譜（TOF/MS）受到人們的關注[14-15]，可對目標物進行準確的篩查。

本研究將分散固相萃?。―SPE）與分散液液微萃取（DLLME）方法相結合，充分利用DSPE、快速提取凈化和DLLME高效濃縮的優(yōu)點，實現(xiàn)從復雜基質中分離目標化合物，通過凈化來減少或消除其他組分的干擾，同時對分析物進行濃縮以達到準確測定痕量殘留物的目的。實驗選擇了在桃生長過程中廣泛使用的農(nóng)藥作為目標分析物，對實驗中影響萃取效率的各個因素進行了考察和優(yōu)化，并利用TOF質譜全掃描及精確質量數(shù)準確篩查的功能，建立了農(nóng)藥化合物碎片的精確質量數(shù)篩查數(shù)據(jù)庫。目前尚未見有關應用DSPE-DLLME-GC-TOF/MS快速篩查桃中多農(nóng)藥殘留的報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 所用的溶劑乙腈、丙酮、乙酸、氯苯、四氯化碳、氯仿（色譜級）均由J.T.Baker（μSA）提供；C18粉（顆粒大小為40～60 μm）、PSA粉（顆粒大小為40～60 μm）、GCB（顆粒大小為120～140目）均購自Agela Technologies公司；氯化鈉、無水乙酸鈉均為分析純；無水硫酸鎂（分析純，用前將其置于500 ℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，待其冷卻后放入干燥器中備用）；純水（Millipore Co，μSA）。

1.1.2 藥品 25種農(nóng)藥標準品均購自美國Dr.Ehrenstorfer.GmbH和Sigma公司，分別用丙酮配置單個純度的農(nóng)藥儲備液（1 000～2 000 mg/L）及混合標準儲備液（10 mg/L），并于-18 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 桃樣品 桃樣品從當?shù)氐某匈徺I。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 分散固相萃取（DSPE）方法：精確稱取15.0 g桃樣品勻漿于100 mL離心管中，加入3.0 g氯化鈉、1.5 g無水乙酸鈉及15.0 mL 1%乙酸乙腈溶液，高速均質1 min后，以5 000 r/min 高速離心2 min；吸取2.0 mL上清液轉入裝有100 mg PSA、100 mg C18、300 mg無水硫酸鎂的5 mL離心管中，渦旋混勻后，以5 000 r/min離心2 min，將上清液過0.22 μm微孔濾膜后，收集于5 mL小燒杯中，供分散液液微萃?。―LLME）方法濃縮使用。

DLLME方法：吸取DSPE過程中凈化后的乙腈上清液（分散劑）1.0 mL于15 mL具塞的尖底離心試管中，再加入50.0 μL氯仿（萃取劑），混勻后，將4 mL的超純水迅速注入到尖底離心管中，輕輕搖晃1 min后，以5 000 r/min離心3 min，將沉積相轉移至微量進樣管（200 μL）后置于2 mL自動進樣小瓶中，用于GC-TOF/MS分析測定。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件 采用6890 GC（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，美國），系統(tǒng)配置電子控制的分流、不分流進樣口。檢測的色譜條件：VF-5色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）；載氣：氦氣（純度為99.999%）；恒流模式，流速：1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1 μL；不分流時間：1 min；進樣口溫度250 ℃；柱溫箱升溫程序：初始溫度70 ℃（保持2 min），以20 ℃/min升溫至190 ℃，再以5 ℃/min升溫至290 ℃（保持5 min）；總運行時間為33 min；傳輸線溫度：270 ℃。

1.3.2 質譜條件 GCT-premier飛行時間質譜儀（Waters，Manchester，μK），配備MassLynx4.0工作站和NIST5.0質譜數(shù)據(jù)庫。質譜參數(shù)如下：電離模式為電子轟擊電離（EI）；轟擊能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；燈絲電流為200 μA；檢測器電壓為2 700 V；質量掃描方式為全掃描；掃描范圍為m/z 50～600；溶劑延遲時間為5 min。質譜將全氟三烴銨（PFTBA）作為內(nèi)標進行調(diào)諧，以218.9856作為鎖定離子來校正分析物碎片的精確質量數(shù)。

2 結果與分析

2.1 GC-TOF/MS數(shù)據(jù)庫的建立

TOF技術是利用特征離子的精確質量數(shù)進行分析，降低了質譜解析的難度，操作簡便，定性及定量準確。TOF篩查數(shù)據(jù)庫建立的關鍵是目標化合物碎片精確質量數(shù)的確定，首先通過全掃描確定化合物的保留時間，去除背景后得到化合物的質譜圖，借助Masslynx 4.1軟件中的Elemental Composition及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對采集的數(shù)據(jù)進行分析，再結合化合物的結構、裂解原理，最后得到目標化合物的元素組成及其對應的理論精確質量數(shù)。一般在實驗的過程中，質量精確度的絕對值小于5×10-6時，均可對物質進行準確的定性分析。每個化合物至少確定2～3個碎片的精確質量數(shù)（表1），25種農(nóng)藥混合標準溶液在0.5 mg/kg下的總離子流色譜圖見圖1。依據(jù)所建立的方法和TOF農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫，在不需要農(nóng)藥標準物質的條件下對實際樣品進行分析，利用精確質量數(shù)、保留時間、離子豐度比等相關信息直接對樣品中的農(nóng)藥進行定性篩查，并對已篩查出的農(nóng)藥繪制標準曲線以進行定量計算，從而實現(xiàn)對目標物的快速定性及準確定量分析。高質量精度可以設定窄窗口進行離子的提取，這樣可降低背景干擾，提高選擇性，獲得定性定量結果（圖2）。

2.2 DLLME方法的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑種類的優(yōu)化 萃取劑的選擇直接影響萃取效率的大小[16]，本研究對實驗中常見的萃取劑四氯化碳（CTC）、氯苯（CB）、氯仿（MCT）進行對比考察。從分析數(shù)據(jù)可知，大約85.7%的農(nóng)藥在氯仿中的萃取效率最大，剩余的農(nóng)藥（其中包括百菌清、馬拉硫磷、溴氰菊酯、喹螨醚4種農(nóng)藥）在四氯化碳中的萃取效率最大，而克菌丹、馬拉硫磷在氯苯中的提取效率為0，其余農(nóng)藥在氯仿中萃取時的提取效率相對較高（圖3）。綜合考慮，選擇氯仿作為萃取劑。

2.2.2 萃取劑體積的優(yōu)化 本研究通過改變氯仿體積，考查其對萃取效率的影響，當萃取劑體積分別為40、50、60 、70 μL時，分散劑乙腈的體積均為1.00 mL，相應的沉淀相體積范圍為12～60 μL。結果表明，當氯仿體積為40 μL時，沉淀量太少，操作不方便，方法的重現(xiàn)性較差；當氯仿的體積從50 μL增加到70 μL時，富集倍數(shù)急劇降低，萃取效率基本不變或增長緩慢，加之氯仿有毒，所以選擇氯仿的最佳萃取體積為50 μL，在確保實驗獲得較高富集倍數(shù)的同時又能在離心后得到適合的沉積相體積，方便吸取且滿足上機測定的需要[17]。

2.2.3 分散劑（提取劑）種類的優(yōu)化 本研究基于DSPE方法的提取劑也是DLLME方法的分散劑，所以要求提取劑既要有較高的提取效率，而且其在分散液液微萃取中也要具有良好的分散作用[18-20]。實驗選擇水果中廣泛使用的提取試劑乙腈、丙酮（pH為5.5的緩沖溶液）進行考察。結果表明，大部分農(nóng)藥在乙腈、丙酮中的萃取效率相當，但由于丙酮對色素等雜質的提取率較高，干擾物較多，所以最終選擇1%的乙酸乙腈作為分散劑（提取劑），利用乙腈上清液將2種方法進行有效結合（圖4）。

2.2.4 分散劑體積的優(yōu)化 分散劑乙腈體積的大小直接影響乳濁液體系的形成、沉積相體積的大小以及萃取效率的高低[21]。本研究中乙腈體積從0.5 mL增加到1.5 mL時，考察其對萃取效率的影響。結果表明，隨著乙腈體積的增大，萃取效率先增加后減小，當乙腈體積為1.0 mL時，萃取效率最大。可能的原因是：當乙腈體積小于1.0 mL時，無法形成良好的乳濁液，使氯仿不能均勻地分散于水相而導致萃取效率降低；而當乙腈體積大于1.0 mL時，則會導致待測物在水相中的溶解度增大，降低萃取效率。當乙腈體積為1 mL時，用50 μL的氯仿萃取劑恰好得到50 μL的沉淀量，方法的重復性較好，所以本研究選擇乙腈的最佳體積為1.0 mL。

2.2.5 水體積的優(yōu)化 從實驗的角度考慮，將分散劑的體積固定為1 mL，改變水相和萃取劑的體積，在滿足獲得相同沉淀相體積的條件下，通過實驗發(fā)現(xiàn)有2種方法（方法一：5 mL水+60 μL氯仿+1 mL乙腈；方法二：4 mL水+50 μL氯仿+1 mL乙腈）均可獲得相同體積的沉淀相。對比二者的萃取效率可知，方法二相對于方法一，25種農(nóng)藥的萃取效率均明顯增加，可能是由于方法一中水溶液過量，導致部分萃取劑溶于水溶液中而未沉淀，同時，溶于水相中的萃取劑攜帶著部分目標物，從而導致萃取效率降低。因此，本研究采用方法二進行萃取，即所選擇的純水體積為4 mL。

2.3 DSPE方法的優(yōu)化

本研究選用空白桃基質，準確稱取15.0 g樣品勻漿于100 mL離心管中，添加30.0 μg/kg混合標準溶液，渦旋后靜置30 min，而后進行相關實驗。

2.3.1 脫水劑的選擇 一般在DSPE中使用無水硫酸鎂吸水萃取，與一些農(nóng)殘的提取方法一樣，使用氯化鈉作為脫水劑[22]。實驗中，當氯化鈉用量為3 g時，離心管的底部有少量的氯化鈉析出，此時認為水相中的鹽分已達到飽和，有機相與水相能夠有效分層。因此，以3 g氯化鈉作為脫水劑與文獻[23]中使用6 g無水硫酸鎂作為脫水劑進行對比，結果表明二者的萃取效率沒有明顯差異。由于無水硫酸鎂在使用前需要進行烘干處理，極為耗時，因此本研究在提取的過程中采用氯化鈉作為脫水劑，而在凈化的過程中使用較少量的無水硫酸鎂吸取乙腈相中可能含有的少量水分。

2.3.2 凈化劑的優(yōu)化 參照文獻[23]，使用PSA去除糖類、脂肪酸和親脂性色素等極性物質，用C18粉去除維生素、色素、甾醇等非極性物質。而GCB主要用于去除色素，但由于其表面的正六元環(huán)結構會吸附一些平面及對稱結構的農(nóng)藥（如百菌清、特丁硫磷等）[24-25]，導致這些組分回收率降低，加之桃基質中色素含量較少，隨著GCB加入量的增加，提取液的顏色基本無變化（圖5），對目標物及儀器的影響很小，所以提取液中不使用GCB凈化。

2.4 方法學驗證

為了評價DSPE-DLLME方法，按照實驗部分所描述的方法制備空白的桃基質，用空白基質配制校正標樣，這樣可以使標準溶液與樣品溶液具有相同的離子化條件，從而消除基質效應[26]。實驗中，每一條校準曲線包括8個點。采用基質匹配標準溶液-外標法定量，分別在空白基質中添加3個水平為10、30、50 μg/kg的混合農(nóng)藥標準溶液，每一水平重復6次，渦旋后靜置30 min，按照實驗部分所描述的方法進行處理，對方法的回收率、重復性、檢出限等進行考察。

多數(shù)農(nóng)藥在可行的范圍內(nèi)線性良好，其線性相關系數(shù)r大于0.98，桃子空白基質在3個不同的添加濃度下，多數(shù)農(nóng)藥的平均回收率為64.9%～119.8%，相對標準偏差（RSD）為3.5%～22.1%。本研究通過向桃空白基質中添加多個較低水平的農(nóng)藥混合標準品溶液，分別進行基質加標實驗，方法的檢出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10）范圍分別為0.01～12.30 μg/kg和0.1～36.7 μg/kg，富集倍數(shù)為20倍（表1）?？梢?，通過與高富集的前處理方法聯(lián)用，提高了樣品中農(nóng)藥殘留檢測的靈敏度，使得GC-TOF可以檢測到更低濃度的目標物（圖6）。結果表明，本方法具有富集倍數(shù)高、靈敏度高的優(yōu)點，可滿足水果中農(nóng)藥殘留檢測的要求。

3 討論與結論

本研究中采用DSPE與DLLME相結合的樣品前處理方法與文獻報道的相關研究有部分差異，Zhao等[17]首次將DLLME用于測定固體樣品黃瓜和西瓜中的農(nóng)藥殘留，其測定過程中同樣使用乙腈作為提取劑和分散劑，提取的乙腈上清液直接用于濃縮；而本研究是采用DSPE方法將乙腈上清液進行凈化后濃縮，這樣有利于復雜基質樣品的分析，防止雜質濃縮后影響檢測結果。

DSPE與DLLME相結合的前處理方法，適合于親脂性高或中等極性的分析物，而從不同的基質中萃取極性和離子型化合物的方法仍需深入研究。 本研究最初選擇了27種農(nóng)藥進行檢測，其中包括抗蚜威、樂果，但因二者具有一定的水溶性，實驗結果發(fā)現(xiàn)其回收率較低，這也證實了DLLME只適合分析親脂性高或中等極性的目標物[16]，可見這2種化合物不適合采用此方法進行提取，故將二者去除。但也有研究表明[27-28]，通過改變DLLME方法的提取方式、分散劑種類等，同樣可以測定部分極性和離子型化合物。

與單四級桿或離子阱相比，TOF具有較高的分辨率，可測定化合物碎片的精確質量數(shù)，TOF-MS的全掃描技術更適合復雜基質中未知物的鑒定和已知物的快速準確篩查分析，但是由于TOF的靈敏度相對較低，線性范圍小，限制了其在農(nóng)藥殘留檢測方面的應用[15]。本研究利用DSPE方法的快速提取凈化結合DLLME方法的高富集效率，建立了桃基質中25種農(nóng)藥多殘留的DSPE-DLLME-GC-TOF/MS快速篩查方法。可見，通過與高富集的前處理方法聯(lián)用，提高了樣品中農(nóng)藥殘留檢測的靈敏度，實現(xiàn)了TOF對農(nóng)藥殘留痕量組分的快速準確定性及定量篩查。本方法具有操作簡單、快速、成本低、有機溶劑消耗少、富集效率高、靈敏度高等優(yōu)勢，滿足水果中農(nóng)藥多殘留檢測限量的要求。

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