朱海峰

【摘? 要】為了探討生物芯片化學發(fā)光免疫法在檢測人TSH和T4中的價值，本研究建立了生物芯片化學發(fā)光免疫法，采集15例患者血清，進行TSH和T4水平檢測，并對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，從而得出結(jié)論：采取生物芯片化學發(fā)光免疫法對人體血清中TSH和T4水平進行檢測時具有較高的靈敏度、線性關(guān)系良好，準確性高，回收率也高，具有廣泛應用的價值。

【關(guān)鍵詞】生物芯片化學發(fā)光免疫法;促甲狀腺激素;甲狀腺激素

Abstract：In order to explore the biological chip chemiluminescence immunoassay in the detection of TSH and T4 value，were established in the study of biological chip chemiluminescence immunoassay，collected 15 cases of serum TSH and T4 levels were detected，and the determination results of statistical analysis，thus draws the conclusion：take on the levels of TSH and T4 in the human body detection serumbiological chip chemiluminescence immunoassay with high sensitivity，good linear relationship，the accuracy is high，the recovery rate is high，has the widespread application value.

Keywords：Biological chip chemiluminescence immunoassay? Thyroid stimulating hormone? Thyroid hormones

為了實現(xiàn)快速、靈敏、低成本的檢驗目的，不少研究者嘗試在生物芯片上展開化學發(fā)光免疫分析實驗^[1，2]。為了探討生物芯片化學發(fā)光免疫法在檢測人TSH和T4中的價值，本研究建立了生物芯片化學發(fā)光免疫法，采集15例患者血清，進行TSH和T4水平檢測，并對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，現(xiàn)將具體情況總結(jié)如下，以供參考。

1儀器和試劑

1.1儀器? 自制圓環(huán)通道生物芯片、BPCL微弱發(fā)光測量儀、電子節(jié)能控溫儀、0.5-10ul可調(diào)定量加樣器、85-1磁力攪拌器、HWY-501循環(huán)恒溫水浴、85-2型恒溫磁力攪拌器、真空干燥箱、KQ3200超聲波清洗器。

1.2試劑? TSH標準濃度血清，牛腸堿性磷酸酶（ALP）標記的TSH抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標記TSH單克隆抗體、偶聯(lián)FITC抗體的磁性分離劑，牛血清白蛋白、氯化鎂為分析純、二乙醇胺為化學純、磁粉。

1.3配制溶液的方法

DEA洗滌液的配制：取10.51gDEA，將其溶解在800ml的純化水中，而后加入1ml1MMgCl₂溶液和0.2g的氯化鈉，幾個氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值在9.8-10之間，經(jīng)0.2um的過濾器對配制溶液進行過濾，即得DEA洗滌液。

充填緩沖液的配制：0.1molL/Tris-HCl-0.05%，pH7.4。

封閉液的配制：含0.1%小牛血清白蛋白的充填緩沖液。

底物稀釋液的配制：pH值為9.18的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液。

2方法和結(jié)果

2.1確定TSH檢測體系實驗條件

2.1.1堿性磷酸酶與底物量的適宜比例

用pH為9.15的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液將堿性磷酸酶稀釋成不同濃度的溶液，使用底物PPD工作濃度200ul在試管內(nèi)，加入10ul的固定酶，混勻后在BPLC微弱化學發(fā)光監(jiān)測以上對發(fā)光值進行觀察，記錄發(fā)光值平衡時的數(shù)據(jù)^[3]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在[ALP]在.64*10-10M左右或以下時的[ALP]與化學發(fā)光值之間存在良好的線性關(guān)系，然而其濃度在1.28X10-12M時生成產(chǎn)物的平衡時間發(fā)生了延長。在堿性磷酸酶濃度在6，4*10-10M與6.4*10-llM范圍之間時，酶與底物的比例最為適宜。

2.1.2芯片式檢測法的實驗操作方法

實驗中經(jīng)適合與免疫反應的微流控生物芯片，在圓環(huán)型的反應池中，線經(jīng)濃度為1%的BSA溶液進行封閉，在37℃條件下孵育20分鐘，而后加入2ul抗原、4ul的抗體以及0.5Ul磁粉，在外加旋轉(zhuǎn)磁場的作用下磁粉旋轉(zhuǎn)會使抗原-抗體的混合加速，在24℃條件下反應7分鐘而后加入2ul的磁珠分離液，在外加旋轉(zhuǎn)磁場的左右下常溫混合5分鐘。在外加磁場的作用下，經(jīng)濾紙將反應池中的液體吸出，而后經(jīng)DEA洗滌液進行反復洗滌。在反應池中加入底物AMPPD溶液后，在外加磁場的作用下常溫反應5分鐘，而后經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測量儀對化學發(fā)光信號進行測量，記錄數(shù)據(jù)^[4]。

2.1.3測定靈敏度

計算靈敏度時采取最低檢測限的方法，分別對濃度為0.075、0.15、0.25和0.5mIU/L的血清平行測定7次，并使用3倍的標準差來確定靈敏度。經(jīng)計算TSH 0mIU/L的標準差為0.03212，3倍標準差作為靈敏度，結(jié)果為0.096mIU/L。

2.1.4標準曲線的制備

經(jīng)芯片法對TSH的線性范圍進行檢測，分別對濃度為0、0.15、0.5、1.5、5、5.0mIU/L的標準血清，每個濃度連續(xù)測定12次，而后將發(fā)光強度作為縱坐標，TSH濃度作為橫坐標，測定TSH濃度在0.094-500.094mIU/L之間存在良好的線性關(guān)系，變異系數(shù)在2.4%-10.2%之間。

2.1.5回收實驗

取高中低三個濃度的血清樣品分別與三種不同濃度的標準血清進行4：1混合，對回收率進行檢測，發(fā)現(xiàn)TSH回收率在91%-101%之間，平均回收率為98.2%。

2.1.6樣品測定

以上述建立方法展開TSH水平檢測，具體步驟為：①芯片的前處理。將鍵合好的芯片放置在濃硫酸中，70℃條件下煮1小時，而后經(jīng)蒸餾水沖洗，在真空干燥箱中進行干燥。②經(jīng)濃度為1%的BSA溶液對反應池進行封閉。將BSA溶液充滿整個反應池，并在37℃條件下孵育30分鐘，而后將反應池吹干，加入2ul各種濃度標準血清，另加入0.5ul磁粉，之后加入2ul的抗體，在磁力攪拌器上進行攪拌混勻，加入2ul的磁性分離劑，繼續(xù)攪拌。③洗滌。經(jīng)濾紙將反應池中的液體吸干，而后經(jīng)DEA洗滌液進行洗滌，連續(xù)3次。洗滌結(jié)束后取10ul底物加入到試管中，經(jīng)磁力攪拌器攪拌5分鐘，最后經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測量儀對化學發(fā)光信號進行測定^[5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本次實驗方法與磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學發(fā)光法的試管檢測之間存在良好的線性關(guān)系，Y_TSH=1.034X_TSH-0.889，r=0.9892。Y_TSH為磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學發(fā)光法檢測TSH，X_TSH為本次實驗方法檢測TSH。

2.2確定T4檢測體系實驗條件

2.2.1芯片式檢測法的實驗操作方法

實驗中經(jīng)適合與免疫反應的微流控生物芯片，在圓環(huán)型的反應池中，線經(jīng)濃度為1%的BSA溶液進行封閉，37℃條件下孵育20分鐘，而后加入1ul抗原、4ulT4衍生物和4ul抗體，最后加入0.5ul的磁粉，在外加磁場的作用下磁粉旋轉(zhuǎn)使抗原-抗體的結(jié)合更加迅速，而后加入2ul的磁珠分離液，常溫下旋轉(zhuǎn)作用5分鐘，經(jīng)濾紙將反應池中的液體吸干，經(jīng)DEA洗滌液進行反復沖洗。在反應池中加入10ul底物，外加磁場作用下常溫反應5分鐘，經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測量儀對化學發(fā)光信號進行測量分析。

2.2.2測定靈敏度

采取最低檢測限法對T4檢測靈敏度進行檢測，取低濃度血清連續(xù)進樣3次，經(jīng)2倍的標準差計算靈敏度，結(jié)果得低濃度T4的0ng/ml血清標準差為2.7ng/ml，靈敏度為4.5ng/ml。

2.2.3標準曲線的制備

在最佳狀態(tài)下，經(jīng)芯片法對T4線性范圍進行測定，分別取濃度為0、20、40、80、150、300ng/ml的標準血清，以化學發(fā)光強度作為縱坐標，T4濃度作為橫坐標，檢測后繪制標準曲線，計算變異系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T4濃度在20-150ng/ml之間存在良好的線性關(guān)系，變異系數(shù)為4.85%。

2.2.4回收實驗

取高中低三個濃度的血清樣品分別與三種不同濃度的標準血清進行4：1混合，對回收率進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T4的回收率在92%-103%之間，平均回收率為99.4%。

2.2.5測定樣品

對上述統(tǒng)計的15例患者血清展開T4水平測定，結(jié)果顯示，本次實驗方法與磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學發(fā)光法的試管檢測之間存在良好的線性關(guān)系，Y_T4=0.99X _T4-2.25，r=0.9981.Y _T4為磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學發(fā)光法檢測T4，X _T4為本次實驗方法檢測T4。

3小結(jié)

在本組研究中，在化學發(fā)光與免疫檢測基礎上加用微流控芯片技術(shù)，建立了生物芯片化學發(fā)光免疫法，成功檢測了TSH、T4水平。由于在檢測過程中，使用了磁粉，使得檢測的速度有所加快，反應時間有所縮短。此外，該法檢測時具有較高的靈敏度，線性關(guān)系良好，準確性高，回收率也高，具有廣泛應用的價值。

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