帕爾哈提·買(mǎi)買(mǎi)提依明　令狐晨　朱青梅等

摘要 [目的]探討昆侖雪菊中總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株（HCT116細(xì)胞、CACO2細(xì)胞）增殖的抑制作用。[方法]體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，采用不同濃度昆侖雪菊中總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率。[結(jié)果]MTT法檢測(cè)昆侖雪菊中總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)昆侖雪菊總黃酮純化物能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞株的凋亡率，且劑量與凋亡率呈正相關(guān)。[結(jié)論]昆侖雪菊總黃酮純化物抗腫瘤活性?xún)?yōu)于總黃酮粗提物及總多糖，且對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖有明顯抑制作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 昆侖雪菊；結(jié)腸癌細(xì)胞；生長(zhǎng)抑制；細(xì)胞凋亡；抗腫瘤

中圖分類(lèi)號(hào) S567.21+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）20-146-03

Abstract [Objective]To investigate the anti-proliferative effect of the total flavonoids， the total polysaccharides from Coreopsis Ticntoria flowers of Kunlun mountain on the colorectal cancer cells. [Method] The colorectal cancer cells were cultured in vitro. The total flavonoids and the total polysaccharides of Coreopsis Ticntoria flowers interene the cells. The viability of cells was measured by MTT. The cell apoptosis was detected with flow cytometry. [Result] Different concentrations of the total flavonoids and the total polysaccharides were cytotoxic to cells in a time and dose dependent manner. The purified extracts of the total flavonoids could enhance apoptisis rate of the cells， and dose and apoptosia rate were positively correlated. [Conclusion] The anti-proliferative effect of purified extracts of the total flavonoids on the cells was stronger than the crude extract of the total flavonoids and the total polysaccharides. The mechanism may be related to the inhibition apoptisis rate of the cells.

Key words Coreopsis Ticntoria flowers of Kunlun mountain； Colorectal cancer cells； anti-proliferation； Apoptisis rate of the cells；Antitumor

昆侖雪菊為菊科金雞菊屬（Coreopsis），是一年生草本植物的干燥頭狀花序，具有獨(dú)特功效的稀有高寒植物[1]。常飲雪菊茶，有神奇的降壓、降脂作用，且具有很好的清肝明目、益肝補(bǔ)陰、美容養(yǎng)顏、潤(rùn)腸通便之特性，對(duì)用眼過(guò)度造成的視覺(jué)疲勞與飲酒造成的肝臟傷害等癥狀有一定的緩解作用[2]。國(guó)內(nèi)關(guān)于雪菊的體外抗腫瘤并未報(bào)道，國(guó)外的報(bào)道僅限于雪菊的單體對(duì)小鼠皮膚腫瘤抑制作用[3]。20世紀(jì)以來(lái)癌癥發(fā)病一直呈上升的趨勢(shì)，腫瘤現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康且較廣泛的疾病，腫瘤的防治也成為世界范圍內(nèi)廣泛重視的課題，不少?lài)?guó)家已注意到使用傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法進(jìn)行防治，特別是對(duì)具有數(shù)千年歷史的中醫(yī)中藥非常關(guān)注[4]。因此該研究探討了昆侖雪菊總黃酮粗提取物、純化物及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

儀器和試劑。CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；Benchmark PLUS型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIORAD公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN公司）；倒置熒光三目顯微鏡（美國(guó)CoolSNAP）；ZHJH1214C型超凈工作臺(tái)（中國(guó)上海智城有限公司）；TP114型電子天平（美國(guó)丹佛公司）；Br4i型低溫離心機(jī)（美國(guó)Jouan公司）；胚胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)141012）；二甲基亞砜（美國(guó)MP Biomedicals公司，批號(hào)M5178 ）；培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)AZG190856）；噻唑藍(lán)MTT（美國(guó)sigma公司，批號(hào)M5655）；凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司，批號(hào)3337788）；胰酶（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)25200）。

1.1.2

腫瘤細(xì)胞。人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116細(xì)胞、CACO2細(xì)胞）由新疆第一附屬醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所阿爾孜古麗·吐?tīng)栠d老師惠贈(zèng)。

1.1.3

藥材。昆侖雪菊為菊科金雞菊屬（Coreopsis）植物，于2013年6～9月在新疆和田地區(qū)昆侖山采集，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為菊科金雞菊品種。

1.1.3.1

昆侖雪菊總黃酮提取物。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，過(guò)三號(hào)篩，備用。稱(chēng)取雪菊適量，按1∶20投料比加50%乙醇40 ml，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀萃取30 min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測(cè)定總黃酮含量為22.56%。

1.1.3.2

總黃酮純化物。由雪菊總黃酮粗提物經(jīng)聚酰胺純化工藝獲得，總黃酮含量為68.04%。

1.1.3.3

昆侖雪菊總多糖。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，過(guò)三號(hào)篩，備用。稱(chēng)取雪菊適量，1∶20投料比，加40 ml蒸餾水，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀，超聲30 min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測(cè)定總多糖含量為24.74%。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)。將人結(jié)腸癌細(xì)胞接種于含10%滅活胚胎血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃飽和濕度及5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2

制備供試液。精密稱(chēng)定雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖浸膏各0.1 g，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，并定容于10 ml容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的3種供試液，4 ℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋分別配制成不同濃度的3種供試液（DMSO體積分?jǐn)?shù)低于0.1%）。

1.2.3

MTT法檢測(cè)樣品對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞、CACO2細(xì)胞分別以3×104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37 ℃飽和濕度及5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后，觀察其貼壁情況，將每孔的培養(yǎng)液取出后，加入系列濃度的待測(cè)樣品溶液。經(jīng)過(guò)初步的篩選后確定試驗(yàn)組設(shè)6個(gè)藥物濃度組，每組藥物的最終濃度為50、100、200、400、600 μg/ml，對(duì)照組加入同樣濃度的DMSO，陽(yáng)性對(duì)照組則為濃度為20 μg/ml的順鉑，每組4個(gè)孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)48、72、96 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，然后每孔加DMSO 150 μl，振蕩充分溶解結(jié)晶物后，用Model550多孔自動(dòng)酶標(biāo)儀比色（波長(zhǎng)490 nm），測(cè)吸光度值，并按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，生長(zhǎng)抑制率=（1-試驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%[5]。

1.2.4

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞、CACO2細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，觀察其貼壁狀況，狀態(tài)良好時(shí)，分別加入100、200、400 μg/ml不同濃度的雪菊總黃酮純化物，并設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組（不加藥物），再置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，把各孔的細(xì)胞培養(yǎng)液分別吸出到15 ml離心管中內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化收集結(jié)腸癌細(xì)胞，充分消化成單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞消化完成后，收集并放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞，加入1 ml PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取含有1×106個(gè)細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入100 μl binding buffer輕輕重懸細(xì)胞，接著分別加入5 μl Annexin VFITC和PI，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，再加入400 μl的binding buffer，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5

統(tǒng)計(jì)方法。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制作用

用濃度分別為50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于HCT116細(xì)胞，72 h后，觀察不同濃度的樣品對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響。由表1可知，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞均有抑制作用，其IC50分別為421.68、69.21、815.68 μg/ml，隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖的抑制率增大，雪菊的不同提取物對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響呈劑量依賴(lài)性。通過(guò)各提取物的IC50比較，雪菊總黃酮的純化物對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于總黃酮的粗提取物及總多糖。

從雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時(shí)不同提取物對(duì)HCT116細(xì)胞作用隨時(shí)間增長(zhǎng)的關(guān)系（圖1）可看出，樣品濃度固定時(shí)，隨著樣品作用時(shí)間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。

2.2 對(duì)結(jié)腸癌CACO2細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制作用

用濃度分別為50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于CACO2細(xì)胞，72 h后，觀察不同濃度的樣品對(duì)CACO2細(xì)胞增殖的影響。由表2可知，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對(duì)結(jié)腸癌CACO2細(xì)胞均有抑制作用，其IC50分別為227.25、155.82、505.30 μg/ml，隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖的抑制率增大，雪菊的不同提取物對(duì)結(jié)腸癌CACO2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響呈劑量依賴(lài)性。通過(guò)各提取物的IC50比較，雪菊總黃酮的純化物對(duì)結(jié)腸癌CACO2細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于總黃酮的粗提取物及總多糖。

由雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時(shí)不同提取物對(duì)CACO2細(xì)胞作用隨時(shí)間增長(zhǎng)的關(guān)系（圖2）可見(jiàn)，樣品濃度固定時(shí)，隨著樣品作用時(shí)間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對(duì)CACO2細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)雪菊總黃酮純化物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙標(biāo)法進(jìn)行凋亡率的測(cè)定，結(jié)果表明（表3），100、200、400 μg/ml的雪菊總黃酮純化物作用HCT116、CACO2細(xì)胞72 h后，隨樣品濃度加大，活細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高。

3 結(jié)論與討論

結(jié)腸癌是世界死因順位中列第3位的腫瘤，盡管結(jié)腸癌的治療手段有很大進(jìn)展，但多年來(lái)晚期結(jié)腸癌的5年生存率并無(wú)多大改觀。因此，結(jié)腸癌預(yù)防的意義愈顯重要。由于主流的治療癌癥的方法有很大的缺陷，世界科學(xué)家開(kāi)始把抗腫瘤藥物研究的目光轉(zhuǎn)移到天然產(chǎn)物上，從不同的中草藥中提取抗腫瘤活性強(qiáng)的成分?？傸S酮具有抗菌抗病毒活性、抗炎、抗腫瘤活性等。

MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞功能的方法。細(xì)胞在活化增殖的過(guò)程中，線粒體的能量代謝能夠把MTT法代謝為藍(lán)紫色的甲臢，甲臢沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周?chē)ㄟ^(guò)二甲基亞砜溶解甲臢，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度值。靈敏度高、簡(jiǎn)單，最常用于體外抗腫瘤藥物篩選的方法。該研究采用MTT法對(duì)雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖進(jìn)行體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株抑制作用的研究，結(jié)果表明，雪菊總黃酮粗提物、總黃酮純化物及總多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株有抑制作用，其中雪菊總黃酮純化物抑制作用最強(qiáng)，從而進(jìn)行雪菊總黃酮純化物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，采用流式細(xì)胞儀Annexin VPI雙標(biāo)法進(jìn)行凋亡率的測(cè)定，結(jié)果表明隨樣品濃度加大，活細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高。綜上所述，昆侖雪菊總黃酮純化物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株有很好的抑制作用，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞有關(guān)。

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