黃居敏 張亞梅 李旸 張普照 楊明

摘要 [目的]優(yōu)化僵蠶中總黃酮的提取工藝，測定僵蠶中總黃酮的含量。[方法]以總黃酮含量為評價指標，采用單因素和Box-Behnken試驗設(shè)計，考察乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、提取次數(shù)、藥材粒徑對僵蠶總黃酮提取效果的影響。[結(jié)果]僵蠶在體積分數(shù)90%乙醇溶液、料液比1∶15（g/ml）的條件下提取1 h的總黃酮得率最高，為1.85%。[結(jié)論]優(yōu)選的總黃酮提取工藝穩(wěn)定可行，建立的含量測定方法準確可靠。

關(guān)鍵詞 僵蠶總黃酮；提取工藝；含量測定

中圖分類號 R282.74 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）34-154-04

僵蠶，又名天蟲、姜蟲，是4～5齡家蠶經(jīng)白僵菌感染僵化而死的干燥蟲體，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結(jié)之功[1]。蠶以桑為食，桑葉中富含黃酮類物質(zhì)，故而蠶體內(nèi)含有大量黃酮類代謝產(chǎn)物。研究表明，蠶體內(nèi)黃酮類化合物與桑葉中的黃酮類化合物在成分上存在差異，不同蠶品種間及不同發(fā)育時期所含黃酮類化合物含量也不同[2-6]。此外，蠶經(jīng)白僵菌侵染后，體內(nèi)化學成分在白僵菌的作用下也會發(fā)生變化。日本學者從僵蠶中分離得到經(jīng)白僵菌轉(zhuǎn)化后的特有產(chǎn)物，其中1個為黃酮類代謝產(chǎn)物[7]。到目前為止，已從僵蠶中分離得到多個黃酮類化合物，如槲皮素7OβD4O甲基葡萄糖苷、山奈酚7OβD4O甲基葡萄糖苷及槲皮素、山奈酚，其中槲皮素7OβD4O甲基葡萄糖苷和山奈酚7OβD4O甲基葡萄糖苷為僵蠶特有的代謝產(chǎn)物[8]。筆者在此在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應用響應面法對僵蠶總黃酮的提取條件進行優(yōu)化，通過研究僵蠶中總黃酮提取工藝進一步指導僵蠶體內(nèi)黃酮類化合物的分離及僵蠶在形成過程中黃酮類化合物的變化規(guī)律研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 僵蠶購自四川省成都荷花池中藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥資源與民族藥研究中心曹嵐副教授鑒定為僵蠶（Bombyx batryticatus）。蘆丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。所用儀器為島津UV2550、電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH6（國華電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制。精密稱定干燥至恒重的蘆丁對照品11.55 mg，置50 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻即得濃度為0.231 mg/ml的標準溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備。各精密稱取僵蠶粉末4 g于100 ml圓底燒瓶中，采用90%的乙醇，按料液比1∶10（g/ml）加熱回流提取1 h，過濾，濾液用相應提取劑定容至100 ml，即得樣品溶液。

1.2.3 方法學考察。

1.2.3.1 線性關(guān)系考察。分別精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml置于10 ml試管中，各加5%NaNO2溶液1 ml，搖勻放置6 min；再加10%Al（NO3）3溶液1 ml，搖勻靜置6 min；加4%NaOH溶液4 ml，搖勻靜置15 min。以同法配制空白對照，在波長500 nm處測定吸光度值，在平行處理的條件下測定3次，求平均值，得回歸方程A=12.458 63C+0.008 17（R2=0.999 01），表明蘆丁對照品在0.023～0.069 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3.2 精密度試驗。精密吸取同一供試品溶液1 ml，按“1.2.3.1”方法連續(xù)測定6次，供試品溶液的吸光度平均值為0.474，RSD=0.4%。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗。精密吸取供試品溶液1份，按“1.2.3.1”方法顯色，于500 nm處測定吸光度，并每間隔5 min測定1次吸光度。結(jié)果在25 min內(nèi)，吸光度平均值為0.46，RSD=2.2%，說明供試品溶液在25 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

1.2.3.4 重復性試驗。取僵蠶粉碎藥材6份，按“1.2.2”和“1.2.3.1”項下供試品溶液的制備及顯色方法處理樣品，于500 nm測定吸光度平均值為0.445，RSD=1.6%，表明該方法重復性良好。

1.2.3.5 加樣回收率試驗。精密量取已知黃酮含量的僵蠶提取液，分別加入一定量的蘆丁對照品溶液，按“1.2.3.1”方法測定，用回歸方程計算總黃酮含量，測得平均加樣回收率為100.01%（表1），RSD=2.81%，表明該法回收率良好。

1.2.4 樣品總黃酮含量測定。精密吸取樣品溶液1 ml置于10 ml試管中，按“1.2.3.1”項下“各加5%NaNO2溶液1 ml至在波長500 nm處測定吸光度值”，在平行處理的條件下測定3次，根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮含量?？傸S酮含量=C×V×V0v×W×1 000×100%，式中，C為標準曲線上查出的質(zhì)量濃度（mg/ml）；V為反應體積（ml）；V0為配制的溶液體積（ml）；v為取樣量（ml）；W為提取物質(zhì)量（g）。

1.2.5 單因素試驗。

1.2.5.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響。采用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比1∶10（g/ml），加熱回流提取1 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.2 料液比對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30（g/ml），80%乙醇加熱回流提取1 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同料液比對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.3 提取時間對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶10（g/ml）、80%乙醇，分別加熱回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.4 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶10（g/ml）、80%乙醇，分別加熱回流提取1、2、3次，每次1 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.5 粒徑對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶10（g/ml）、80%乙醇，分別對過2號篩、3號篩、4號篩、5號篩、6號篩的僵蠶粉末加熱回流提取1次，提取時間1 h，平行3組，濾液定容至100 ml，測定其吸光度值，考察不同粒徑對總黃酮提取率的影響。

1.2.6 響應面法優(yōu)化總黃酮最佳提取工藝。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、提取時間3個因素為主要考察因素，應用DesignExpert 8.0軟件，設(shè)計3因素3水平的響應面試驗（表2），利用響應面試驗結(jié)果，即取僵蠶粉末4 g，精密稱定，按BoxBehnken Design設(shè)計表中的條件進行提取，過濾后定容至100 ml容量瓶中，按“1.2.3.1”方法顯色后測定吸光度，確定僵蠶中總黃酮的最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對僵蠶總黃酮含量的影響。由圖1可見，總黃酮含量隨乙醇濃度的升高先增加后降低，當乙醇濃度為80%時，總黃酮含量最高，故選80%乙醇為最佳提取溶劑。

2.1.2 料液比對僵蠶總黃酮含量的影響。從圖2可以看出，當料液比為1∶10（g/ml）時總黃酮含量最高，故選1∶10作為總黃酮提取的料液比。

2.1.3 提取時間對僵蠶總黃酮含量的影響。由圖3可見，在1 h時總黃酮含量最高，故選1 h作為提取時間。

2.1.4 提取次數(shù)對僵蠶總黃酮含量的影響。圖4顯示，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮含量變化不大，考慮到時間和經(jīng)濟成本，提取1次。

2.1.5 粒徑對僵蠶總黃酮含量的影響。從圖5可看出，隨著粒徑的減小，總黃酮含量增加，但3～6號篩增幅不大，故綜合考慮選取過3號篩但不過7號篩的僵蠶粉末作為研究對象。

2.2 響應面法優(yōu)化總黃酮最佳提取工藝試驗結(jié)果 通過DesignExpert 8.0軟件對響應面法試驗優(yōu)化僵蠶總黃酮提取工藝的結(jié)果（表3）進行分析，發(fā)現(xiàn)回歸模型極其顯著（P<0.000 1），說明建立的模型有意義；失擬項P=0.739 6>0.05，無顯著性差異，說明模型擬合度良好（R2=0.972 0），表明可用此模型和方程來分析和預測僵蠶總黃酮的提取率。以僵蠶中總黃酮得率為響應值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方

程：總黃酮得率=1.63+0.28A+0.072B+0.10C-0.031AB+0.056AC-0.050BC-0.20A2-0.33B2-0.11C2。經(jīng)檢驗，回歸模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.935 9，說明此模型能解釋93.59%響應值的變化，即此模型與數(shù)據(jù)擬合度較好。回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果顯示，模型的一次項中A（乙醇濃度）、B（提取時間）、C（料液比）均顯著，其中A影響程度最為顯著；二次項B2影響為極顯著，A2、C2顯著。由此可知，各影響因素間不是簡單的線性關(guān)系。在選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序為乙醇濃度>料液比>提取時間。

2.3 各因素間的交互作用 從響應面分析圖可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)間的相互作用，若曲線越陡，表明該因素對總黃酮得率的影響越大，相應表現(xiàn)為響應值變化的大小；而由等高線可以看出為橢圓形表明兩因素間交互作用較顯著。從圖6可以看出，乙醇濃度對總黃酮得率影響最大，料液比次之，與方差分析結(jié)果相吻合。

2.4 驗證試驗 通過軟件分析確定僵蠶總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度90%、料液比1∶15、提取時間1 h，此條件下計算出的總黃酮得率理論值為1.76%。依據(jù)確定的最佳提取工藝進行驗證試驗（n=5），得總黃酮平均得率為1.85%，RSD=2.13%，測定結(jié)果穩(wěn)定，證明該結(jié)果合理可靠。

3 結(jié)論與討論

該試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應用響應面分析法優(yōu)化僵蠶總黃酮的提取工藝得出：僵蠶在體積分數(shù)90%乙醇溶液、料液比1∶15（g/ml）的條件下提取1 h的總黃酮得率最高，為1.85%，與模型預測值相符。表明該法優(yōu)選的總黃酮提取工藝穩(wěn)定可行，建立的含量測定方法準確可靠。

僵蠶作為臨床上常用的蟲類藥材，其總黃酮的藥理活性及物質(zhì)基礎(chǔ)研究較為薄弱，該試驗通過對總黃酮提取工藝的研究，對后續(xù)僵蠶中黃酮類化合物的分離制備及藥理學研究具有一定的指導作用。

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