孫慧娟

摘要 [目的]篩選出高寒地區(qū)蛹蟲草搖瓶液體培養(yǎng)基的最佳配方。[方法]以菌絲體干質(zhì)量濃度為指標，首先采用單因素試驗方法篩選出液體培養(yǎng)基中的最優(yōu)碳源和氮源，然后運用方差分析得出最佳碳氮肥比（C/N）。[結(jié)果]遼寧某企業(yè)提供的蛹蟲草菌株液體培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，碳氮肥比為2∶1和1∶1時均可使菌絲達到較大的生物量。[結(jié)論]該研究為高寒地區(qū)蛹蟲草的液體發(fā)酵培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 高寒地區(qū)；蛹蟲草；液體培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號 S567；Q949.327.6 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-152-02

蛹蟲草[Cordyceps militaris（ L.） Link]又名北蟲草、北冬蟲夏草等，隸屬于菌物界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、蟲草菌科（Cordycipitaceae）。到目前為止，在全世界范圍有近400種的蟲草屬真菌被報道，其中常見的被人們所熟知的有冬蟲夏草、蟬花、蛹蟲草、霍克斯蟲草等，其中以冬蟲夏草和蛹蟲草最為重要。由于冬蟲夏草目前尚不能人工栽培且野生資源逐年下降，不能滿足市場需求資源十分稀缺。而人工栽培的蛹蟲草與野生的冬蟲夏草主要的營養(yǎng)成分和藥用成分十分相近，甚至有的高于冬蟲夏草，所以蛹蟲草的商品化生產(chǎn)應(yīng)運而生。研究表明，采用液體培養(yǎng)的蟲草菌絲體，其所含的主要成分與天然子實體十分接近[1]，且具有培養(yǎng)條件易控制、產(chǎn)量高、生長周期短且活性物質(zhì)易于提取等特點，有望成為野生蟲草的替代品[2-4]。因此，該試驗對蛹蟲草在高寒地區(qū)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化試驗，以培養(yǎng)出的菌絲干質(zhì)量濃度為衡量指標，篩選出最佳的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料 由遼寧某企業(yè)提供的蛹蟲草菌株。

1.2 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基配方 葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蒸餾水1 000 ml。

1.3 接種及培養(yǎng)方法 將斜面試管蛹蟲草菌株分成0.5 cm的小塊，接種于已滅菌的裝有250 ml液體培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，每個處理重復(fù)2次。

1.4 菌絲體生物量測定方法 采用菌絲體干質(zhì)量法，取發(fā)酵液100 ml，分裝于4個50 ml離心管中，配平后離心，3 000 r/min，備用。

1.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化方法

1.5.1 最佳碳、氮源的篩選試驗?；A(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源采用葡萄糖、蔗糖，以20 g/L添加，以不含碳源的培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復(fù)2次；在三角瓶中分別用搖床培養(yǎng)5 d和靜置培養(yǎng)7 d，測定菌絲體干質(zhì)量濃度，通過培養(yǎng)出的菌絲體干質(zhì)量濃度的不同來比較不同碳源對其影響。選取蛋白胨、酵母浸出粉作為有機氮源進行單因素試驗分析，以10 g/L添加，其他方法同上。

1.5.2 液體培養(yǎng)基中不同碳氮肥比（C/N）對菌株菌絲體干質(zhì)量濃度的影響。將篩選到的最佳碳源、有機氮源按2∶1、1∶2、1∶1 3種配比進行試驗，液體培養(yǎng)基中各成分具體加入量如表1所示，每個處理重復(fù)2次。比較不同C/N的培養(yǎng)基對培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量濃度的影響。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SAS 9.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳碳、氮源的篩選試驗 通過靜置培養(yǎng)的菌絲生長情況對比（圖1）可以直觀地看出，以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基三角瓶中菌絲生長最密，其次是葡萄糖，不加碳源的CK菌絲生長量最少，同時也說明碳源是作為液體培養(yǎng)基中的一個非常重要的營養(yǎng)因子。從圖1可以看出最佳碳源是蔗糖。通過圖2也可以明顯看出最利于菌絲培養(yǎng)的碳源是蔗糖。

通過靜置培養(yǎng)的菌絲生長情況（圖3）可以直觀地看出，以蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基三角瓶中菌絲生長最密，其次是酵母浸出粉，不加氮源的CK菌絲生長量最少，幾乎沒有，同時也說明

氮源是作為液體培養(yǎng)基中的一個非常重要的營養(yǎng)因

子。從圖3可以看出最佳氮源是蛋白胨，通過圖4也可以明顯看出最利于菌絲培養(yǎng)的氮源是蛋白胨。

從圖2和圖4也可以看出，同樣溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)的菌絲明顯高于靜置培養(yǎng)的菌絲生長量。

2.2 不同碳氮肥比（C/N）對菌株菌絲體干質(zhì)量濃度的影響 將篩選到的最佳碳源蔗糖、有機氮源蛋白胨按1∶2、2∶1、1∶1 3種配比進行試驗，測得的菌絲干質(zhì)量濃度分別為4.28、6.00、5.90 g/L，經(jīng)方差分析得出，當碳氮肥比為2∶1和1∶1時菌絲干質(zhì)量濃度無顯著差異，均得到了較高的生物量，碳氮肥比為1∶2時，菌絲干質(zhì)量濃度與其他2種碳氮比下的菌絲生長量存在顯著差異，且明顯低于后兩者，所以對于遼寧某企業(yè)提供的蛹蟲草菌株液體培養(yǎng)基的碳氮比為2∶1或1∶1情況下均利于其菌絲生長，對其他蛹蟲草的液體發(fā)酵培養(yǎng)也有一定的指導(dǎo)意義。

3 討論

最佳碳、氮源的篩選試驗結(jié)果表明，蔗糖最有利于蛹蟲草菌絲的生長，這與周廣麒等[5]的研究結(jié)果一致，而蔡友華等[6]和劉苗苗等[7]篩選出的蛹蟲草菌絲生長的最佳碳源是葡萄糖，這可能與蛹蟲草菌株的性狀不同有關(guān)系；在氮源篩選試驗中，當液體培養(yǎng)基中未加氮源時菌絲生長量幾乎為零，而在碳源篩選試驗中未加碳源的情況下菌絲生長量也很少但明顯高于未加氮源的培養(yǎng)基中的菌絲量，說明氮源對蛹蟲草液體發(fā)酵的影響較明顯，這與孫佳巖[8]的研究結(jié)果一致。

由不同碳氮肥比（C/N）對菌絲體生長影響的試驗結(jié)果可見，當碳源所加的量相同時，氮源加量的多少對菌絲的生長影響不顯著；而當加入同樣量的氮源時，菌絲體干質(zhì)量濃度在加入不同碳源的情況下存在顯著性差異，同樣說明了碳源的重要性。

參考文獻

[1] 張緒璋.北冬蟲夏草的人工培植及其營養(yǎng)成分分析[J].中國食用菌，2003，22（2）：19-21.

[2] 侯友松，周廣麒，于玲，等.麥芽汁培養(yǎng)基中蛹蟲草液體發(fā)酵的研究[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2000，19（4）：271-273.

[3] 王國棟.冬蟲夏草類生態(tài)培植應(yīng)用[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，1995：168-171.

[4] 梁宗琦.我國蟲草屬真菌的研究開發(fā)的現(xiàn)狀與思考[J].食用菌學(xué)報，2001，8（2）：53-62.

[5] 周廣麒，戴娜.響應(yīng)面法優(yōu)化蟲草培養(yǎng)的研究[J].中國釀造，2011（1）：112-115.

[6] 蔡友華，范文霞，劉學(xué)銘，等.響應(yīng)面法優(yōu)化巴西蟲草發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J].食用菌學(xué)報，2007，14（2）：55-59.

[7] 劉苗苗，寧尚勇，崔西勇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草液體培養(yǎng)條件[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（5）：127-131.

[8] 孫佳巖.蛹蟲草液體深層發(fā)酵的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012：7-10.