羅海斌　李春?！”R家仕　屈婷婷　曾宋君　卜朝陽

摘 要 為篩選出適宜在廣西南寧地區(qū)種植的優(yōu)良鐵皮石斛種源，并為下一步篩選優(yōu)良品系和遺傳育種提供參考依據(jù)。以5種不同種源鐵皮石斛為試驗(yàn)材料，在南寧地區(qū)引種栽培2 a后，觀察其生物學(xué)性狀，測定葉綠素和糖類含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同種源地的鐵皮石斛生物學(xué)性狀、葉綠素和糖類含量均呈現(xiàn)出差異；云南河口鐵皮石斛生物學(xué)性狀表現(xiàn)良好，葉綠素含量中等，但多糖和甘露糖含量較低。浙江樂清種源株高最矮，葉面積最小，葉綠素含量最低，但多糖含量較高，甘露糖含量中等。廣西桂平鐵皮石斛莖較粗，葉片寬大，葉綠素含量、多糖含量中等，甘露糖含量最高。廣西玉林和桂平鐵皮石斛生物學(xué)性狀相近，多糖含量最高，甘露糖含量較低；廣西樂業(yè)鐵皮石斛莖細(xì)，葉片狹長，葉綠素含量最高，多糖和甘露糖較高。說明廣西桂平和廣西樂業(yè)2個(gè)種源在南寧地區(qū)的適應(yīng)性較好，品質(zhì)較高，適宜推廣種植。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；生物學(xué)性狀；糖類含量

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In order to select the suitable varieties of Dendrobium officinale to cultivate in Nanning area and provide information for screening excellent varieties and genetic breeding. Five different germplasm resources of D. officinale were introduced and cultured in Nanning City in Guangxi. The biological characters， chlorophyll contents and saccharides components of them after two years planting were studied. The study found that the five Dendrobium officinale from different origins had different biological characters， chlorophyll contents and saccharides components. The biological characteristics of the D. officinale in Hekou City in Yunnan was good， its content of chlorophyll was medium， but its content of polysaccharide and mannitol was low. The plant height of the D. officinale in Yueqing City in Zhejiang was the shortest. Its leaf area was the smallest and the content of chlorophyll was the lowest，but the content of polysaccharide was higher and the content of mannose was medium. The stem of the D. officinale in Guiping City in Guangxi was thick. Its leaf area was large， the content of chlorophyll and polysaccharide was medium， but the content of mannose was the highest. The biological characteristics of the D. officinale in Yulin city and Leye city in Guangxi was close. The content of polysaccharide was the highest， but the content of mannose was lower. The stem of the D. officinale in Leye City in Guangxi was the thinnest. Its leaf area was narrow， the content of chlorophyll was the hightest and the content of polysaccharide and mannose was high. The results showed that the two germplasm resources of D. officinale in Guiping City in Guangxi and in Leye City in Guangxi had better adaptability and were suitable to plant in Nanning area.

Key words Dendrobium officinale；Biological characteristics；Saccharides component

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.020

鐵皮石斛（Dendrobium officinale kimura et migo）屬于蘭科石斛屬植物，在中國安徽、浙江、福建、廣西、四川、云南等地均有分布，自古以來作為一種珍貴藥用植物使用，由于過度采挖和其生態(tài)環(huán)境的破壞，野生鐵皮石斛數(shù)量稀少，野生種瀕臨滅絕[1]，但目前鐵皮石斛市場需求量大，人工栽培是一條有效的解決途徑。由于鐵皮石斛在中國分布較廣，不同種源地的鐵皮石斛的生物學(xué)性狀、生理特性、糖類含量等方面呈現(xiàn)出差異性，且不同氣候環(huán)境對鐵皮石斛的生長品質(zhì)有一定影響[2]。鐵皮石斛的表型性狀也具有較高的遺傳多態(tài)性，利用莖粗、葉長和葉寬等性狀指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以為資源篩選和遺傳改良提供依據(jù)[3]。葉片葉綠素含量是反映鐵皮石斛適應(yīng)性的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)，在一定光強(qiáng)范圍內(nèi)，增大光強(qiáng)有利于提高葉片葉綠素含量，這可能歸因于較大光強(qiáng)有助于提升氮素吸收能力[4]；而較大的氮素吸收能力又與良好的根系性狀相關(guān)[5]。光質(zhì)的強(qiáng)弱和配比還會影響不同時(shí)期鐵皮石斛的生長和有效物質(zhì)的積累[6]。多糖和甘露糖作為鐵皮石斛重要的糖類物質(zhì)，是評價(jià)鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標(biāo)[7]，不同葉片形態(tài)的鐵皮石斛多糖含量存在差異性[8]，但是由于生態(tài)環(huán)境的差異，如溫度、光照和水分等因素對鐵皮石斛的影響，導(dǎo)致多糖等糖類含量也會發(fā)生改變[9]。

本研究以5個(gè)不同種源地的鐵皮石斛為試驗(yàn)材料，結(jié)合生物學(xué)性狀、生理指標(biāo)和糖類成分含量進(jìn)行測定，研究不同種質(zhì)鐵皮石斛的生長和糖類成分含量高低，以期篩選出適宜在廣西南寧地區(qū)種植的優(yōu)良鐵皮石斛種源，為下一步篩選優(yōu)良品種和遺傳育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自云南河口、廣西桂平、廣西玉林、廣西樂業(yè)、浙江樂清等地的原生種源鐵皮石斛，每份樣品100株，均為幼苗期引進(jìn)栽培，分別編號為266、310、311、489、491。在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所科研試驗(yàn)大棚引種栽培2 a后，取開花植株進(jìn)行形態(tài)特征、葉綠素、糖類含量測定分析。

試劑：購自上海國藥公司，其中無水葡萄糖、苯酚、硫酸、無水乙醇、乙酸銨、鹽酸氨基葡萄糖、甘露糖、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷等均為分析純，乙腈和甲醇為色譜純。

儀器：Waters液相色譜儀（美國waters公司），ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國Agilent公司），水浴鍋（江蘇金壇中大儀器廠），烘箱（上海一恒儀器公司），高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市百信藥機(jī)器械廠），低速離心機(jī)（伯樂公司），紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），索氏提取器（上海洪紀(jì)公司），手持式葉綠素儀（日本柯尼卡美能達(dá)）。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征測定 參照劉志高等[10]的方法，稍有改變。每個(gè)種源隨機(jī)抽取樣本10株，利用直尺、游標(biāo)卡尺測量株高、莖尖至下第3節(jié)直徑、頂葉的長和寬（其相對面積和長寬比分別以長寬積和長寬比表示）等形態(tài)指標(biāo)。

1.2.2 葉綠素含量測定 使用葉綠素儀SPAD-502活體測定鐵皮石斛葉片SPAD值。每個(gè)品種隨機(jī)抽取10株樣品，于上午9：00～10：00測量，選取莖中部葉片，避開葉脈測定。

1.2.3 多糖和甘露糖含量測定 多糖測定參照《中華人民共和國藥典（2010年版）》的方法[11]，每個(gè)樣品平行提取3次進(jìn)行測定，每次測定重復(fù)3次，取平均值。

甘露糖測定：甘露糖測定參照《中華人民共和國藥典（2010年版）》的方法[11]。

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L乙酸銨緩沖液-乙腈（80：20）。柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel 2003軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入、分析和制圖。結(jié)果采用Duncan法進(jìn)行品種間差異性比較，pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，分層聚類法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源鐵皮石斛生物學(xué)特性比較

2.1.1 株高 5種不同種源的鐵皮石斛經(jīng)過2 a的引種栽培后，廣西樂業(yè)種源株高最高，為294.33 mm，云南河口、廣西玉林、廣西桂平種源分別為258.00、249.33、235.00 mm，浙江樂清品種株高最矮，為231.33 mm；廣西樂業(yè)、浙江樂清種源與其它種源呈顯著性差異；廣西玉林種源與云南河口、廣西桂平種源之間株高無顯著性差異（圖1）。

2.1.2 莖粗 云南河口種源莖粗最粗，達(dá)到5.96 mm，廣西玉林和浙江樂清種源分別為4.65 mm和4.60 mm，廣西樂業(yè)種源莖粗最細(xì)為4.43 mm；云南河口種源與廣西桂平、廣西樂業(yè)、浙江樂清種源之間莖粗呈顯著性差異（圖2）。

2.1.3 相對葉面積 云南河口種源葉面積最大，為821.89 mm2，廣西玉林和廣西桂平種源葉面積相似，分別為691.38 mm2和685.01 mm2，浙江樂清種源葉面積最小，為359.49 mm2；云南河口、廣西樂業(yè)、浙江樂清種源與其它種源葉面積呈顯著性差異；廣西玉林、廣西桂平種源之間葉面積無顯著性差異（圖3）。

2.1.4 葉綠素SPDA值 葉綠素是吸收光能的主要物質(zhì)，葉片的吸收量與光線的波長息息相關(guān)，通過2種波長范圍內(nèi)的透光系數(shù)來確定葉片當(dāng)前葉綠素的相對數(shù)量。廣西樂業(yè)種源SPAD值含量最高，其平均值為59.17，廣西玉林、云南河口和廣西桂平種源SPAD值分別為53.43、51.43、49.13，浙江樂清種源SPAD最低，為41.17；浙江樂清種源與其它種源之間SPAD值呈顯著性差異；云南河口、廣西玉林、廣西桂平、廣西樂業(yè)種源之間SPAD值無顯著性差異（圖4）。

2.2 多糖含量測定

不同種源的鐵皮石斛多糖含量均在25%以上，均符合國家藥典要求，其中廣西玉林種源鐵皮石斛多糖含量最高，為39.5%；其次為廣西樂業(yè)種源，含量為39%；廣西桂平和浙江樂清種源分別為32.6%和31.3%；云南河口種源最低，為25.9%（表1）。

2.3 甘露糖測定

不同種源鐵皮石斛甘露糖含量各有不同；廣西桂平種源甘露糖含量最高，為25.7%，其次是廣西樂業(yè)種源，含量為22.8%，廣西玉林和浙江樂清種源含量分別為17.7%和16.7%，云南河口種源含量最低，為12.9%（表1）。

2.4 植物學(xué)性狀與糖類之間相關(guān)性

莖粗、葉長等主要農(nóng)藝性狀之間呈顯著正相關(guān)；株高與多糖、甘露糖等糖類成分呈正相關(guān)，莖粗、葉長、葉寬、葉長寬比和糖類成分呈負(fù)相關(guān)，植物學(xué)性狀與糖類成分均不呈現(xiàn)顯著相關(guān)性；多糖與甘露糖2個(gè)主要糖類成分呈正相關(guān)，但不顯著（表2）。

2.5 聚類分析

依據(jù)歐氏距離法對5個(gè)種源進(jìn)行分層聚類分析，將5個(gè)種源劃分成4個(gè)類群（圖5），類群一為廣西玉林和廣西桂平種源，此類群植株葉片較大，中等株高，中等莖粗。類群二為云南河口種源，葉面積最大，莖粗最粗。類群三為廣西樂業(yè)種源，此類群株高最高，葉片中等大小，莖粗最細(xì)。類群四為浙江樂清種源，此類群株高較矮，葉片細(xì)小，莖粗較粗。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同種源鐵皮石斛性狀分析

在植物學(xué)性狀比較中，形態(tài)學(xué)標(biāo)記是最簡單、直觀的方法。本研究采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記，利用差異顯著分析與分層聚類分析法相結(jié)合，結(jié)合前人的研究進(jìn)展[3]，以7個(gè)植物學(xué)性狀結(jié)合糖類指標(biāo)，可以把5個(gè)不同種源的鐵皮石斛分為4個(gè)類群：云南河口種源莖粗最粗，葉片寬大；廣西玉林和廣西桂平種源在性狀上具有相似性，莖粗中等，葉片較寬大，株高中等；廣西樂業(yè)種源葉片狹長，葉面積大小中等，株高最高；浙江樂清種源株高最矮，葉面積最小。通過對這5個(gè)不同種源地鐵皮石斛進(jìn)行分類能夠較好地了解不同類群遺傳距離大小，為鐵皮石斛雜交選育和優(yōu)良品系選育提供依據(jù)，但是性狀測定僅表現(xiàn)植物的表觀特性，需要結(jié)合多糖等指標(biāo)進(jìn)一步篩選。

3.2 不同種源鐵皮石斛葉綠素SPAD值

植物的生長發(fā)育需要依靠葉綠素對光能的吸收利用，葉綠素光合色素是植物原初光反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因子，其含量的變化往往與葉片的生理活性、植物對環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)[12]。鐵皮石斛作為兼性景天酸植物，國內(nèi)對石斛類植物光合特性及光合作用與環(huán)境條件的關(guān)系研究不多[13]， 而有關(guān)不同種源地鐵皮石斛葉綠素不同變化未見有報(bào)道。沈宗根[14]等對美花石斛、春石斛和鐵皮石斛的葉綠素含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉綠素的含量高于其他2種石斛，葉綠素含量的增加保證了葉片在弱光照環(huán)境下吸收更多光能用于光合作用。本研究結(jié)果表明，廣西樂業(yè)鐵皮石斛種源的葉綠素SPAD值最高，浙江樂清鐵皮石斛種源最低，表明廣西樂業(yè)鐵皮石斛在本地具有更好的環(huán)境適應(yīng)性。

3.3 不同種源鐵皮石斛糖類成分含量分析

石斛多糖是評價(jià)鐵皮石斛品質(zhì)的重要指標(biāo)，藥理研究證明多糖具有增強(qiáng)免疫機(jī)能、抗氧化等作用[15]。有研究證明，人工栽培鐵皮石斛在生理年齡第二年時(shí)采摘最好，多糖含量最高，品質(zhì)最優(yōu)[16]。另外，已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)不同種源地鐵皮石斛多糖含量具有差異性，但對不同種源地多糖含量高低具有爭議[17-18]。徐程等[17]對8種不同產(chǎn)地的鐵皮石斛多糖含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)浙江富陽種源多糖含量最高，云南種源次之，廣西和湖南種源最低。冷春鴻等[18]對溫州地區(qū)4個(gè)不同地區(qū)鐵皮石斛種源多糖含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)浙江雁蕩地區(qū)鐵皮石斛多糖含量最高，其他依次為福建、廣西、云南。本研究結(jié)果表明，廣西玉林和廣西樂業(yè)2個(gè)種源地的鐵皮石斛含量最高，其次為廣西桂平種源和浙江樂清種源，云南河口種源最低。經(jīng)過長時(shí)間的馴化，不同的種質(zhì)對區(qū)域氣候已產(chǎn)生了相應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制[8]，根據(jù)廣西的氣候、土質(zhì)等條件下通過調(diào)控多糖控制基因的表達(dá)量大小引起多糖含量的差異。

甘露糖是單糖類物質(zhì)，廣泛分布于人體組織中，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抑制細(xì)菌感染，抑制巨噬炎癥細(xì)胞等功效[19]。甘露糖含量高低可以作為鐵皮石斛的品質(zhì)評價(jià)之一，但對不同生長期含量高低一直存在爭議。周桂芬[20]等對不同年份鐵皮石斛甘露糖含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)含量高低與年份沒有相關(guān)性，隨著生長年限的增加，鐵皮石斛甘露糖含量降低。各產(chǎn)地鐵皮石斛甘露糖含量差異可能與鐵皮石斛的種質(zhì)資源、栽培管理、地理環(huán)境氣候和附生物等有密切相關(guān)[21]。戚輝等[22]利用HPLC法測定甘露糖含量，顯示廣東丹霞地區(qū)鐵皮石斛的含量最高，云南文山，安徽霍山和浙江溫州鐵皮石斛的含量依次下降。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西桂平種源其含糖量最高。

鐵皮石斛糖類含量隨著生長年限提高而提高，在2年齡，糖類含量最高[16]。前期研究顯示，廣西樂業(yè)地區(qū)鐵皮石斛2年齡的糖類含量比前期測定的6月齡顯著增加；而對另外6月齡廣東地區(qū)鐵皮石斛糖類含量測定發(fā)現(xiàn)，其糖類含量高于同時(shí)期廣西樂業(yè)地區(qū)種源，其在南寧地區(qū)適應(yīng)性可能會好于廣西樂業(yè)種源，有待日后驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明，5個(gè)不同種源鐵皮石斛均在同一時(shí)期種植在同一地點(diǎn)，并且栽培條件完全相同，經(jīng)過在大棚引種栽培2年后，5種不同種源地的鐵皮石斛生物學(xué)性狀、葉綠素SPAD值和糖類均呈現(xiàn)出差異性。鐵皮石斛的引種栽培，應(yīng)充分考慮生態(tài)環(huán)境氣候的影響，結(jié)合農(nóng)藝性狀和糖類含量為參考。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西桂平和廣西樂業(yè)2個(gè)種源在南寧地區(qū)的適應(yīng)性較好，適宜推廣種植。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳韻琴， 斯金平. 鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展的探討[J]. 中國中藥雜志， 2010， 35（15）： 2 033.

[2] 丁小余， 徐 紅， 施國新， 等. 鐵皮石斛居群差異的研究（I）植物體形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異[J]. 中草藥， 2001， 32（9）： 828-831.

[3] 張振臣， 陳俊標(biāo)， 馬柱文， 等. 鐵皮石解種質(zhì)資源主要表型性狀的差異與相關(guān)分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（8）： 78-80.

[4] 張 明， 陳仕江， 萬兆良， 等. 光照強(qiáng)度對金釵石斛吸收氮素的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000（2）： 108-111.

[5] 李 武， 鄭錦榮， 莫釗文， 等. 光照強(qiáng)度對鐵皮石斛組培幼苗生長及生理特性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2014， 35（1）： 121-125.

[6] Lin Y， Li J， Li Bo， et al. Effects of light quality on growth and development of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale in vitro[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2011， 105： 329-335.

[7] 楊 虹， 王順春， 王崢濤， 等. 鐵皮石斛多糖的研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2004（4）： 18-20.

[8] 毛靈芝. 不同栽培條件下鐵皮石斛（Dendrobium candidum）光合特性和主要藥用成分的變化[D]. 杭州： 浙江師范大學(xué)， 2008.

[9] 龔慶芳， 周 浩， 王新桂， 等. 不同產(chǎn)地鐵皮石斛的品質(zhì)比較研究[J]. 北方園藝， 2013（8）： 162-165.

[10] 劉志高， 朱 波， 斯金平， 等. 鐵皮石斛F1代苗期農(nóng)藝性狀研究[J]. 中國中藥雜志，2013，38（4）：498-503.

[11] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 265-266.

[12] 艾天成， 李方敏， 周治安， 等. 作物葉片葉綠素含量與SPAD值相關(guān)性研究[J]. 湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2000， 20（1）： 6-8.

[13] 丑敏霞， 朱利泉， 張玉進(jìn)， 等. 不同光照強(qiáng)度和溫度對金釵石斛生長的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2001（3）：325-330.

[14] 沈宗根， 陳翠琴， 王嵐嵐，等. 3種石斛光合作用和葉綠素?zé)晒馓匦缘谋容^研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2010， 30（10）： 2 067-2 073.

[15] Liu X F， Zhu J， Ge S Y， et al. Orally administered Dendrobium officinale and its polysaccharides enhance immune functions in BALB/c mice[J]. Natural Product Communications， 2011， 6（6）： 867-870.

[16] 諸 燕， 斯金平， 郭寶林， 等. 人工栽培鐵皮石解多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變異規(guī)律[J]. 中國中藥雜志， 2010， 35（4）：427-430.

[17] 徐 程， 詹忠根，廖蘇梅. 8種不同地域鐵皮石斛農(nóng)藝性狀及多糖和纖維素分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2008， 5（5）： 576-579.

[18] 冷春鴻， 張 征， 吳志剛，等. 溫州地區(qū)4個(gè)鐵皮石解栽培品種的形態(tài)特征與多糖含量分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（8）： 1 261-1 263.

[19] Lin X， Shaw P C， Sze S C W， et al. Dendrobium officinale polysaccharides ameliorate the abnormality of aquaporin5， pro-inflammatory cytokines and inhibit apoptosis in the experimental Sjogrens syndrome mice[J]. International Immunopharmacology， 2011， 11（12）： 2 025-2 032.

[20] 周桂芬， 呂圭源. 柱前衍生化HPLC分析不同來源、不同生長年限鐵皮石斛多糖的組成和含量[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2011， 46（8）： 626-629.

[21] 苑 鶴， 白燕冰， 斯金平， 等. 柱前衍生HPLC分析鐵皮石斛多糖中單糖組成的變異規(guī)律[J]. 中國中藥雜志，2011， 35（18）： 2 465-2 470.

[22] 戚 輝， 陳 健， 易燕群， 等. 不同產(chǎn)地鐵皮石斛形態(tài)及有效部位成分含量比較[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013， 30（4）： 558-561.