李榕，孫杰，余恒琳

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京210019）

西式發(fā)酵香腸中生物胺含量的調(diào)查分析

李榕，孫杰，余恒琳

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京210019）

綜述生物胺的種類、危害及在西式發(fā)酵香腸中存在的可能，采集了西式發(fā)酵香腸的樣本，檢測(cè)了其5種生物胺（尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺）及4種微生物（乳酸菌、微球菌、腸細(xì)菌、假單胞菌）的含量。經(jīng)分析得出結(jié)論：5種生物胺在西式發(fā)酵香腸中普遍存在；腸細(xì)菌的數(shù)量與生物胺的含量有顯著的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)其他3種微生物與生物胺含量之間的關(guān)系。

西式發(fā)酵香腸；生物胺；調(diào)查；分析

生物胺（biogenic amines，BA）是一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環(huán)類低分子化合物，食品中的生物胺主要由微生物產(chǎn)生的脫羧酶催化氨基酸脫羧而產(chǎn)生［1］。適量的生物胺有助于人體正常的生理功能，過(guò)量則會(huì)引起不良的生理反應(yīng)，可導(dǎo)致血壓升高，頭痛，臉色潮紅，出現(xiàn)皮疹。還會(huì)導(dǎo)致胃腸功能紊亂，包括突然出現(xiàn)嘔吐和腹瀉，并伴隨腹痛等癥狀［2］。因此對(duì)生物胺進(jìn)行研究可以提高和改善食品的質(zhì)量及安全性。

發(fā)酵肉制品是世界上公認(rèn)的生物胺重要來(lái)源［3］。國(guó)外對(duì)發(fā)酵肉制品中的生物胺已做了大量的調(diào)查，認(rèn)為生物胺在發(fā)酵香腸中普遍存在，只是不同的發(fā)酵肉中存在的種類和數(shù)量不同［4］。發(fā)酵肉制品中生物胺的產(chǎn)生和累積相當(dāng)復(fù)雜，受原料肉的特性、微生物的種類和數(shù)量、生產(chǎn)工藝及貯藏條件、添加劑等影響［5］。本研究從西式發(fā)酵香腸（如薩拉米）入手，通過(guò)采集樣品，檢測(cè)并分析其5種生物胺（尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺）及4種微生物（乳酸菌、微球菌、腸細(xì)菌、假單胞菌）的含量，論證西式發(fā)酵香腸中微生物與生物胺之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

市購(gòu)西式發(fā)酵香腸共13批樣品：A組（比薩香腸2批、巴瑪香腸1批），B組（金字香腸2批、薩拉米香腸3批、），C組（帕爾馬香腸1批、薩拉米香腸1批），D組（巴瑪香腸2批）、E組（黑森林香腸1批）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑及培養(yǎng)基

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺和丹磺酰氯Merck公司；

乙腈和丙酮為色譜純Merck公司；硝酸銀、高錳酸鉀、草酸鈉、乙酸鋅、硫氰酸鉀、亞鐵氰化鉀、氨水、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、D-甘露醇、氯化鈉、酚紅等為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；自制超純水（明澈-D 24UV，Millipore公司）；MRSA培養(yǎng)瓊脂，VRBDA培養(yǎng)基，假單胞分離瓊脂，泰普生物科技（中國(guó)）有限公司；牛肉膏、蛋白胨、MSA瓊脂等購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司

1.2.2 主要儀器設(shè)備

DELTA-320型pH計(jì)：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；F6/10型超細(xì)勻漿機(jī)：上海弗魯克流體機(jī)械；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ESCO-A2型生物安全柜：惠諾德（北京）科技有限公司；SX-700型高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；1810D型實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)：上海摩勒生物科技有限公司；Agilent1200型DAD高效液相色譜儀：安捷倫公司；HHS-28S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海精風(fēng)儀器有限公司；PL202-L型電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；L303-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱：滬申通試驗(yàn)電器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)

取20 g香腸，加入到180 mL已滅菌的蛋白胨生理鹽水中，在200 r/min、室溫下?lián)u10 min，取1 mL再用生理鹽水逐級(jí)稀釋到適當(dāng)濃度。乳酸菌用MRS培養(yǎng)基，在30℃條件下培養(yǎng)72 h；微球菌用MSA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h；腸細(xì)菌用VRBGA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h；假單胞菌用假單胞菌分離培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)72 h。

1.3.2 生物胺的檢測(cè)方法

檢測(cè)方法在GB/T5009.208-2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》［6］的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了條件的優(yōu)化［7］。圖1為生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。

圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1HPLC chromatograms of biogenic amine standard solutions

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱為C-18反相柱，4.6×150 mm2，粒徑5 μm，為了獲得較好的分離效果，選擇不同的流動(dòng)相并結(jié)合梯度洗脫對(duì)樣品進(jìn)行分離，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取酪胺、尸胺、組胺、精胺、亞精胺各50 mg，用0.4 mol/L的高氯酸（HClO4）定容至50 mL，制成儲(chǔ)備液備用。

分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用0.4 mol/L HClO4配制成終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、20、50、75 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后進(jìn)行衍生處理、分析，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲線，5種生物胺的峰面積與其相應(yīng)濃度分別呈良好的線性關(guān)系，其中尸胺的相關(guān)系數(shù)為0.999 9，其它生物胺的相關(guān)系數(shù)也都大于0.99，生物胺的濃度在1 μg/mL～75 μg/mL的范圍內(nèi)是線性相關(guān)的。

1.3.2.3 樣品的衍生

1 mL的生物胺標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，加入200 μL的2NNaOH使之呈堿性，然后再加入300 μL的飽和NaHCO3溶液緩沖，再加入1 mL的丹磺酰氯溶液（10 mg/mL丙酮），在黑暗中置于40℃的水浴中，30 min后取出，加入100 μL的氨水中斷反應(yīng)，并去除多余的丹磺酰氯。最后用乙腈調(diào)整到5 mL。將其用0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后用于檢測(cè)。

1.3.2.4 樣品溶液的制備

取5 mL或5 g的待測(cè)樣品（乳酸菌發(fā)酵液），加入20 mL 0.4 mol/L HClO4溶液，均質(zhì)后2 500 r/min離心5 min。沉淀部分再用上述步驟抽提，兩次的上清液合并在一起，再用0.4 mol/L HClO4定容至50 mL。取1 mL的酸提取液按1.3.2.3中的方法衍生。

1.3.2.5 檢測(cè)限

以信噪比（S/N）大于3作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。尸胺、亞精胺、組胺的檢測(cè)限為0.05 μg/mL，酪胺的檢測(cè)限為0.1 μg/mL，精胺的檢測(cè)限為0.25 μg/mL。

1.3.2.6 精密度及衍生物穩(wěn)定性試驗(yàn)

為確定方法的精密度，分別以3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5、10、50 μg/mL）進(jìn)行測(cè)試，5種生物胺在高、中、低3種濃度下，精密度良好。

為確定衍生物的穩(wěn)定性，以5種生物胺的丹磺酰氯衍生物溶液在選定的色譜條件下，在3天內(nèi)分別進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)峰面積變化不大，丹磺酰氯衍生物比較穩(wěn)定。但為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好是樣品處理好之后立即測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1 生物胺含量調(diào)查

調(diào)查的13批西式發(fā)酵香腸中5種生物胺含量如表1所示。

通過(guò)對(duì)不同樣品生物胺總量聚類分析，可將這13種西式發(fā)酵香腸分為4組。第一組是生物胺低含量的香腸即A組，總量為（0.01～200mg/kg）；第二組是生物胺中等含量的香腸即B組，總量為（200～400 mg/kg）；第三組是生物胺較高含量的香腸即C組，總量為（400 mg/kg～600 mg/kg）；第四組是生物胺高含量的香腸即D組，總量為（600 mg/kg～1 000 mg/kg）；第五組是生物胺超高含量的香腸即E組，總量為大于1 000 mg/kg。FDA規(guī)定食品中生物胺總量不得超過(guò)1 000 mg/kg。從檢測(cè)結(jié)果分析，13批西式發(fā)酵香腸中均檢出5種生物胺，可見(jiàn)五種生物胺在西式發(fā)酵香腸中普遍存在。2.2微生物對(duì)生物胺含量的影響

表1 發(fā)酵香腸中生物胺含量調(diào)查結(jié)果（mg/kg，n=6）Table 1Investigation results of biogenic amines content in west style fermented sausage（mg/kg，n=6）

發(fā)酵香腸中產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶微生物主要有假單胞菌、腸細(xì)菌、微球菌和乳酸菌［1］。本研究樣品中各種微生物數(shù)量見(jiàn)表2。

在所有樣品中均未檢測(cè)到假單胞菌，這可能由于假單胞菌細(xì)胞壁較薄，在成熟后期香腸的水份活度變低，食鹽含量相對(duì)有所增加，致使其失活。腸細(xì)菌的數(shù)量從1.70 log cfu/g到4.52 log cfu/g，其數(shù)量與生物胺含量顯著相關(guān)（r=0.7286）。乳酸菌和微球菌，是傳統(tǒng)中式香腸中優(yōu)勢(shì)菌，數(shù)量分別是從3.53 log cfu/g到7.78 log cfu/g和從2.70 log cfu/g到6.12log cfu/g。從檢測(cè)數(shù)據(jù)分析，本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)乳酸菌和微球菌與生物胺含量之間的必然聯(lián)系。

表2 發(fā)酵香腸微生物特性調(diào)查結(jié)果（n=6）Table 2Investigation results of microbial charateristics in west style fermented sausage（n=6）

3討論

由于目前我國(guó)西式發(fā)酵香腸的生產(chǎn)企業(yè)較少，國(guó)內(nèi)有2家大型企業(yè)生產(chǎn)的西式發(fā)酵香腸市場(chǎng)占有率較高。因此本研究的樣品均來(lái)自這兩個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，檢測(cè)的重點(diǎn)指標(biāo)是生物胺含量和微生物指標(biāo)，目的是從原料的原始菌相著手，從宏觀上找出微生物菌種與西式發(fā)酵香腸中相關(guān)聯(lián)系。

從檢測(cè)結(jié)果分析，樣本中均檢出五種生物胺，腸細(xì)菌的數(shù)量與生物胺含量有顯著的相關(guān)性（r=0.728 6），這可能與腸細(xì)菌產(chǎn)生氨基酸脫羧酶能力強(qiáng)有關(guān)［8］。與Latorre-Moratalla等觀點(diǎn)基本一致［9］，未發(fā)現(xiàn)乳酸菌、微球菌和假單胞菌與生物胺含量之間的關(guān)系。

［1］李平蘭，沈清武.干發(fā)酵香腸中生物胺的產(chǎn)生與控制［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（11）：59-64

［2］馮婷婷，方芳，楊娟，等.食品生物制造過(guò)程中生物胺的形成與消除［J］.食品科學(xué)，2013，34（19）：360-366

［3］張春江，楊君娜，王芳芳，等.肉制品中生物胺產(chǎn)生與控制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2010，7：17-20

［4］李志軍，吳永寧，薛長(zhǎng)湖.生物胺與食品安全［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（10）：84-91

［5］王翔，盧士玲，徐幸蓮，等.發(fā)酵肉制品中生物胺的形成及影響因素研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（11）：133-136

［6］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/ T5009.208-2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》［S］.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社.2008：1-4

［7］盧士玲，徐幸蓮，舒蕊華，等.傳統(tǒng)中式香腸中生物胺調(diào)查研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（10）：141-146

［8］通力嘎，靳志敏，段艷，等.發(fā)酵香腸中生物胺含量影響因素的研究進(jìn)展［J］.肉類研究，2012，26（4）：36-39

［9］LATORRE-MORATALLA ML，BOVER-CID S，TALON R，et al. Strategies to reduce biogenic amine accumulation in traditional sausage manufacturing［J］.LWT-Food Science and Technology，2010，43（1）：20-25

Investigation and Analyse the Content of Biogenic Amines in Western Style Fermented Sausage

LI Rong，SUN Jie，YU Heng-lin
（Product Quality Supervision and Inspection Institute of Nanjing，Nanjing 210019，Jiangsu，China）

Summarize the biogenic amines species，toxicity，the presence of these compounds in western style fermented sausage.This paper collecting the western style fermented sausage samples，detecting five species of biogenic amines（Cadaverine，Histamine，Tyramine，Spermidine，Spermine）and four kinds of microbes（Lactobacillus、Micrococcu、Enteric bacteria、Pseudomonadaceae）.Analysis the following conclusions：the five species of biogenic amines are widespread in western style fermented sausage；there were a significant correlation between the auantity of Enteric bacteria and the content of biogenic amines；no relationship was found between the the content of biogenic amines and the other microbes.

western style fermented sausage；biogenic amines；investigation；analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.025

2014-10-26

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAK21B00）南京青奧會(huì)支撐技術(shù)集成應(yīng)用與示范

李榕（1971—），女（漢），碩士，高級(jí)工程師，主要研究方向：食品安全與檢測(cè)。