馮超，尤玲玲，何慶鋒，肖萍，劉金福，*

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384；2.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津300384）

苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮改善HepG2/IR的聯(lián)合作用研究

馮超1，2，尤玲玲2，3，何慶鋒2，3，肖萍2，3，劉金福2，3，*

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384；2.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心，天津300384）

探討苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單一組分及聯(lián)合使用對胰島素抵抗的改善作用。建立胰島素抵抗人肝癌細胞模型，設立正常組、胰島素抵抗組、鹽酸吡格列酮陽性對照組、苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單獨干預組，苦瓜皂苷和南瓜多糖、苦瓜皂苷和苦蕎黃酮、南瓜多糖和苦蕎黃酮聯(lián)合干預組，測定葡萄糖消耗量、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的含量，MTT法評價細胞活性，蛋白免疫印跡法檢測細胞葡萄糖轉運體4的表達。結果表明，多數(shù)生理生化指標、細胞活性和GLUT4的表達聯(lián)合組與單一組分相比有顯著性差異（P＜0.05）；采用析因分析，苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮聯(lián)合在改善葡萄糖消耗量和谷丙轉氨酶上具有交互協(xié)同作用（P＜0.05）。

胰島素抵抗；苦瓜皂苷；南瓜多糖；苦蕎黃酮；HepG2/IR模型；聯(lián)合作用；析因分析

胰島素抵抗作為一種常見的病理狀態(tài)，是2型糖尿病（T2DM）等多種疾病的共同發(fā)病基礎，其發(fā)生的主要原因是由于高熱量飲食或體力活動的減少，以及應激狀態(tài)、遺傳因素等導致機體對胰島素作用的反應性減弱，使其維持血糖的能力下降，而引起糖、脂肪和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)代謝障礙［1］。因此，對于T2DM的治療應建立在降低胰島素抵抗的基礎上。建立胰島素抵抗細胞模型，可從細胞水平探討改善胰島素抵抗的途徑和效果。肝臟是胰島素抵抗產(chǎn)生的主要部位，而HepG2細胞源于人的肝胚胎瘤細胞，是一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，在高水平的胰島素條件下會導致HepG2細胞表面胰島素受體的數(shù)目下降，因此HepG2是研究改善胰島素抵抗效果的理想細胞模型，被廣泛應用［2-3］。

研究表明，來自于苦瓜、南瓜和苦蕎的苦瓜皂苷（Momordica charantia saponins，MCS），南瓜多糖（Cucurbita moschata polysaccharide，CMP）和苦蕎黃酮（Fagopyrum tataricum flavones，F(xiàn)TF）3種植物活性成分，均能不同程度的發(fā)揮降血脂、降血糖，改善胰島素抵抗的功效［3-4］，但聯(lián)合復配作用效果研究報道較少。本文通過建立HepG2/IR細胞模型，考察MCS，CMP和FTF聯(lián)合復配使用改善胰島素抵抗的效果。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

苦瓜皂苷、南瓜多糖提取物，實驗室自制；苦蕎黃酮，購于開魯縣昶輝生物技術有限責任公司；HepG2細胞：中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、標準胎牛血清：美國HyClone；牛胰島素、胰蛋白酶（1∶250）、二甲基亞砜（DMSO）、蛋白質(zhì)含量測定試劑盒、硝酸纖維素膜：北京Solarbio；MTT、一抗為兔抗GLUT-4、二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG：天津博美科生物技術公司；葡萄糖測定試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司；鹽酸吡格列酮：北京太洋藥業(yè)有限公司；低分子量蛋白Marker：美國Thermo公司；ECL顯色液：英國Advansta公司；HDL、LDL、AST和ALT測定試劑盒：中生北控生物科技公司。

1.2 儀器

蛋白質(zhì)電泳儀、轉膜儀器、凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；ELX800型全自動酶標儀：美國Bio-Tek公司；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Forma公司；IX51倒置相差熒光顯微鏡：日本Olympus公司；GLAMOUR3000型魅力全自動生化儀：美國MD公司。

1.3 方法

1.3.1 三種活性成分的制備

苦瓜皂苷提取物采用醇提法制備，經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂純化后純度為58.5%。提取物中皂苷含量通過以人參皂苷Rg1為標準品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸紫外顯色法進行測定［5］。

南瓜多糖提取物采用水提醇沉的方法制備，純度為48.3%。多糖含量為提取物中總糖含量和還原糖含量之差。其中南瓜多糖和還原糖含量測定分別采用蒽酮比色法和3，5-二硝基水楊酸比色法［6］。

購買的苦蕎黃酮提取物經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂純化后純度達72.3%。以蘆丁為標準品，分光光度法進行測定含量［7］。

1.3.2 HepG2/IR模型的建立及分組

課題組前期試驗得到高濃度胰島素誘導HepG2細胞建立胰島素抵抗模型的最佳作用時間為36 h，最佳胰島素濃度為30μg/mL［8］。以細胞密度為2×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h，分別設立NC、IR、4 μg/mL PH、750 μg/mL MCS、500 μg/mL CMP和500μg/mLFTF單獨干預組，750μg/mLMCS和500μg/mL CMP、750 μg/mL MCS和500 μg/mL FTF、500 μg/mL CMP和500 μg/mL FTF聯(lián)合干預組，孵育12 h后進行相應指標的測定，各提取物干預劑量為前期試驗測得的緩解胰島素抵抗的最佳劑量。

1.3.3 葡萄糖消耗量和培養(yǎng)液生化指標的測定

孵育結束后，3 600 r/min離心10 min，取細胞培養(yǎng)上清液。按葡萄糖試劑盒測定方法測定細胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。公式如下：

葡萄糖濃度（mmol/L）=標準品濃液×（樣品管OD-空白管OD）/（標準管OD-空白管OD）

用自動生化儀測定上清液中HDL、LDL、AST和ALT的含量。

1.3.4 細胞活性的測定

MTT法測定細胞活性［9］。

1.3.5 免疫印跡實驗

設立NC、IR、MCS、CMP和FTF單獨組，MCS和CMP、MCS和FTF、CMP和FTF聯(lián)合組，濃度設置同1.3.2。

提取各組細胞蛋白質(zhì)［10］，BCA法測定總蛋白的濃度。經(jīng)12%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE分離蛋白。在4℃下，采用濕轉法，用含有5%脫脂奶粉TBST封閉1 h，按1∶500稀釋GLUT-4一抗，4℃過夜。洗膜，按1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫1 h，洗滌，與ECL顯色液反應5 min，曝光。利用凝膠成像系統(tǒng)中Image Lab軟件分析進行定量分析，計算蛋白條帶與β-actin的光密度比值［11］。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±S）表示，組間均數(shù)比較用t檢驗，析因分析采用F檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有極顯著性。

2結果與分析

2.1 三種活性成分單獨和聯(lián)合對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗量和細胞活性的影響

三種活性成分單獨和聯(lián)合對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗量的影響見圖1。

圖1 苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單獨及聯(lián)合對葡萄糖消耗量的影響Fig.1Single operation and combined effect of MCS，CMP and FTF on the glucose consumption（x±S，n=6）

圖1所示，干預12 h后，MCS，CMP和FTF單獨組和聯(lián)合組葡萄糖消耗量與IR組比較，差異性顯著（P＜0.05），說明活性成分提取物促進了細胞對葡萄糖的吸收，顯著改善了胰島素抵抗的狀態(tài)（P＜0.05）。CMP在聯(lián)合了MCS或FTF后，其消耗葡萄糖情況顯著優(yōu)于單獨作用的CMP或FTF組（P＜0.05）；MCS和FTF聯(lián)合組與單獨作用的FTF組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。總的來說，兩種物質(zhì)聯(lián)合可以進一步促進HepG2/IR細胞葡萄糖消耗，緩解胰島抵抗的效果更明顯。

三種活性成分單獨和聯(lián)合對HepG2/IR細胞細胞活性的影響見圖2。

圖2 苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單獨及聯(lián)合對細胞活性的影響Fig.2Effect of cell survival of MCS，CMP and FTF on HepG2/IR（x±S，n=6）

由圖2可以看出，與NC組相比，IR組、PH組、MCS，CMP和FTF單獨組和聯(lián)合組，細胞活性均低于NC組，可能是因為胰島素抵抗作用降低了HepG2細胞的活性；各提取物組與IR組比較，細胞活性均有所提高，MCS和FTF聯(lián)合組細胞活性提高顯著高于FTF組（P＜0.05）；其余聯(lián)合組與單一組比較雖差異性不顯著（P＞0.05），但活性均有所改善。

從葡萄糖消耗量與細胞活性兩個方面綜合考慮，聯(lián)合組可能更好地通過提高細胞對胰島素的敏感性、修復細胞的損傷，而增加葡萄糖的攝取和利用［12］。聯(lián)合組葡萄糖消耗量與單一組相比，均有不同程度的增加，說明聯(lián)合組對于胰島素抵抗所產(chǎn)生的葡萄糖細胞內(nèi)的糖代謝紊亂功能的改善效果更好一些，從而促進糖酵解功能的發(fā)揮，提高了葡萄糖消耗量。

2.2 三種活性成分單獨和聯(lián)合作用對HepG2/IR細胞上清液中生化指標的影響

三種活性成分單獨和聯(lián)合作用對HepG2/IR細胞上清液中生化指標的影響見表1。

表1 苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單獨及聯(lián)合對HepG2/IR細胞上清液中生化指標的影響Table 1Single operation and combined effect of MCS，CMP and FTF in the physiological and biochemical parameters of HepG2/IR cell（±S，n=6）

表1 苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單獨及聯(lián)合對HepG2/IR細胞上清液中生化指標的影響Table 1Single operation and combined effect of MCS，CMP and FTF in the physiological and biochemical parameters of HepG2/IR cell（±S，n=6）

注：同一肩注不同字母者表示比較組之間有顯著差異P＜0.05（字母順序按平均值由大到小依次對應），同一肩注含有相同字母者表示比較組之間無顯著差異P＞0.05。

ALT/（U/L）NC0.93±0.13d0.038±0.015a1.29±0.29a1.08±0.09aIR0.53±0.04a0.120±0.005f6.11±0.54f6.11±0.54dPH0.86±0.16c0.042±0.011a3.69±0.48d2.49±0.48bMCS0.71±0.14b0.105±0.019c4.92±0.53c5.04±0.30cCMP0.65±0.05b0.095±0.013c5.21±0.33c5.34±0.49cFTF0.65±0.15b0.1025±0.016c5.09±0.53c5.16±0.19cMCS+CMP0.82±0.07c0.075±0.006b3.94±0.25b2.43±0.39bMCS+FTF0.76±0.05bc0.081±0.012bc3.8±0.16b2.65±0.34bCMP+FTF0.81±0.07c0.083±0.01bc3.87±0.49b2.79±0.54b組別HDL/（mmol/L）LDL/（mmol/L）AST/（U/L）

糖、脂代謝紊亂是胰島素抵抗的主要原因。從表1中可見，IR組的AST、ALT和LDL的含量顯著高于NC組，HDL含量低于NC組（P＜0.05），說明胰島素抵抗嚴重影響到細胞內(nèi)物質(zhì)的代謝。給予提取物作用12 h后，AST、ALT和LDL的含量均不同程度的降低，HDL含量有所提升，說明在胰島素抵抗的狀態(tài)下，MCS，CMP和FTF可以改善糖、脂代謝等紊亂現(xiàn)象。MCS在聯(lián)合CMP或FTF時，對于AST和ALT兩個指標的改善作用優(yōu)于各單一成分組（P＜0.05），對于LDL改善，MCS和CMP組顯著優(yōu)于單一組（P＜0.05）；CMP與FTF聯(lián)合對于HDL、AST和ALT的改善作用優(yōu)于各單一成分（P＜0.05）。

HepG2/IR細胞受損，胞膜破裂，細胞中的AST、ALT含量高于正常組，由實驗結果我們可以推測，聯(lián)合組比單一組更利于改善HepG2/IR細胞損傷程度，從而保護細胞膜的完整性，使得膜上胰島素受體更好地結合，進而增強了細胞對胰島素的敏感性；同時，通過HDL、LDL的含量變化，說明聯(lián)合組能更好的促進細胞內(nèi)的脂類物質(zhì)分解消除，緩解脂代謝紊亂而起到改善胰島素抵抗的發(fā)生［13-15］。

2.3 三種活性成分聯(lián)合作用的析因分析

為進一步了解聯(lián)合作用的方式，兩種物質(zhì)之間是否存在協(xié)同交互作用，采用2*2析因設計，分析細胞上清液中的各種生化指標，結果如表2～表4。

當聯(lián)合組P＜0.05，證明兩種物質(zhì)之間有協(xié)同作用。析因分析結果表明，在葡萄糖消耗量與ALT兩個指標的改善上，聯(lián)合組中兩個物質(zhì)之間存在協(xié)同的作用。葡萄糖消耗量代表著細胞對于葡萄糖的利用攝取能力，ALT作為反映肝細胞損傷程度的指標，ALT的增加則說明細胞對糖類物質(zhì)的代謝和轉化能力增強，兩者均為糖代謝的指標，說明植物活性成分配伍使用可通過改善糖代謝緩解胰島素抵抗。而對于其他三種指標不存在協(xié)同作用，可能是由于物質(zhì)間疊加的量效關系導致指標的改善。

表2 苦瓜皂苷和南瓜多糖聯(lián)合對葡萄糖消耗量、AST、ALT、LDL和HDL析因分析結果Table 2Combined effect of MCS and CMP on the glucose consumption，AST，ALT，LDL and HDL in factorial analysis

表3 苦瓜皂苷和苦蕎黃酮聯(lián)合對葡萄糖消耗量、AST、ALT、LDL和HDL析因分析結Table 3Combined effect of MCS and FTF on the glucose consumption，AST，ALT，LDL and HDL in factorial analysis

表4 南瓜多糖和苦蕎黃酮聯(lián)合對葡萄糖消耗量、AST、ALT、LDL和HDL析因分析結果Table 4Combined effect of CMP and FTF on the glucose consumption，AST，ALT，LDL and HDL in factorial analysis

2.4 三種活性成分單獨和聯(lián)合作用對HepG2/IR細胞GLUT4表達的影響

三種活性成分單獨和聯(lián)合作用對HepG2/IR細胞GLUT4表達的影響見圖3～圖5。

圖3 苦瓜皂苷與南瓜多糖對HepG2/IR細胞GLUT4表達的影響Fig.3Western blot analysis of GLUT4 expression in MCS and CMP groups

圖4 苦瓜皂苷與苦蕎黃酮對HepG2/IR細胞GLUT4表達的影響Fig.4Western blot analys is of GLUT4 expression in MCS and FTF groups

圖5 南瓜多糖與苦蕎黃酮對HepG2/IR細胞GLUT4表達的影響Fig.5Western blot analysis of GLUT4 expression in CMP and FTF groups

圖3～圖5顯示了NC組、IR組以及苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮單獨及聯(lián)合中GLUT4的表達。正常HepG2細胞GLUT4表達呈一條較強的條帶，HepG2/ IR細胞GLUT4表達呈一條較弱的條帶，兩組光密度比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。GLUT4是胰島素抵抗的重要分子基礎之一，負責攝取受胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖，在胰島素抵抗狀態(tài)下GLUT4轉位受到障礙，不能與胰島素相應抗體結合導致細胞對葡萄糖攝取以利用減少，從而阻礙了其表達。單獨和聯(lián)合較IR組相比，對于GLUT4表達有顯著性提高（P＜0.05）。CMP與MCS或FTF聯(lián)合，對于提高GLUT-4表達聯(lián)合組優(yōu)于單一組（P＜0.05），可能是當MCS、CMP或FTF聯(lián)合使用時，加速對細胞葡萄糖的利用與轉運，從而改善胰島素抵抗現(xiàn)象的發(fā)展［16］。

3結論

通過建立HepG2/IR模型，從葡萄糖消耗量、細胞活性、AST、ALT、LDL、HDL以及GLUT4表達量等方面，采用單因素方差分析和析因分析方法，探討苦瓜皂苷、南瓜多糖和苦蕎黃酮聯(lián)合改善胰島素抵抗的作用效果，結果顯示，聯(lián)合組對于改善胰島素抵抗的效果優(yōu)于單一組；且聯(lián)合組在改善葡萄糖消耗量和ALT中存在著協(xié)同交互作用，為進一步研究植物活性成分在改善胰島素抵抗方面的聯(lián)合作用提供了借鑒。

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Combined Effects of Momordica Charantia Saponins，Cucurbita moschata Polysaccharide and Fagopyrum Tataricum Flavones on the Insulin Resistance HepG2 Model

FENG Chao1，2，YOU Ling-ling2，3，HE Qing-feng2，3，XIAO Ping2，3，LIU Jin-fu2，3，*
（1.Animal Science and Veterinary Medicine College，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.Food Science and Bioengineering College，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；3.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

The effects of Momordica charantia saponins（MCS），Cucurbita moschata polysaccharide（CMP）and Tartary buckwheat flavones（FTF）on insulin resistance were investigated in this study.HepG2/IR model was established and randomly divided into the nine groups（NC，IR，PH，MCS，CMP，F(xiàn)TF，MCS and CMP，MCS and FTF，CMP and FTF groups）.Afterwards，the contents of GC，HDL，LDL，AST and ALT were determined. The cell survival was estimated by MTT method and GLUT4 expression was detected by Western blot.The results showed that most of physiological and biochemical indexes，cell survival and the expression of GLUT4 were significant different between the combined groups and single component in cell model（P＜0.05）.To improve on the glucose consumption and ALT（P＜0.05）by factorial analysis in MCS，CMP and FTF.

insulin resistance；Momordica charantia saponins；Cucurbita moschata polysaccharide；Fagopyrum tataricum flavones；HepG2/IR model；combined effect；factorial analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.003

2015-04-09

天津市科技支撐計劃項目（13ZCZDNC01800）

馮超（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：動物性食品安全。

*通信作者：劉金福（1961—），男（漢），教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學與功能食品。