王永娟　王岑　朱善元　左偉勇

摘要：無(wú)菌采取鵝外周血并進(jìn)行抗凝處理，以全血提取法、細(xì)胞分離直接提取法、細(xì)胞分離培養(yǎng)提取法及細(xì)胞分離誘導(dǎo)提取法分別提取外周血中淋巴細(xì)胞的總RNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和得率；以總RNA為模板通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增鵝α-干擾素（GoIFN-α）基因，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEMT-α，通過(guò)比較GOIFN-α序列確定各種提取方法的可行性。結(jié)果顯示，4種方法提取的RNA純度高，均可作為模扳擴(kuò)增出目的基因，滿足后續(xù)的分子生物學(xué)研究；其中以細(xì)胞分離直接提取法制備的RNA產(chǎn)量最多，此結(jié)論為外周血淋巴細(xì)胞總RNA的提取提供了一種更快捷的方法。

關(guān)鍵詞：外周血；淋巴細(xì)胞；RNA提?。籖T-PCR；方法比較；鵝；干擾素

中圖分類號(hào)：S858.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0204-02

干擾素是真核細(xì)胞對(duì)各種刺激作出反應(yīng)而自然形成的一組復(fù)雜且具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。刺激產(chǎn)生干擾素的外源因素主要有病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，如植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）。在外源因素刺激下，原處于Go期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，從而獲得豐富的含有絲分裂且生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞群體，終止分裂中期的淋巴細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，即可得到1個(gè)表達(dá)細(xì)胞因子的cDNA庫(kù)。多個(gè)報(bào)道顯示，為獲取目的基因，一般在外源因素刺激后再提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA，本研究嘗試采用多種方法制備總RNA并擴(kuò)增目的基因，以探索一種最為快捷簡(jiǎn)便的外周血淋巴細(xì)胞總RNA提取方法，為其他細(xì)胞因子的分離奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

成年揚(yáng)州白鵝購(gòu)自揚(yáng)州瑞農(nóng)科技有限公司；刀豆球蛋白（conA）購(gòu)自Sigma公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；禽淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)白天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase、RNaseInhibitor、TaqDNA聚合酶、1kbDNALadderr、PrestainedProtein分子量marker、pGEM-TEasyVectorSystem、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；膠回收試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、DH5cα大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已發(fā)表的GoWN-α基因序列（登錄號(hào)：HQll5583）設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擬擴(kuò)增的全長(zhǎng)序列為576bp。引物F1：5'-ATGCCTGGGCCATCAGCCCCAC-3'和R1：5'一TTAGCGCAT—GGCGCGGGTGAGG-3'由上海Invitrogen公司合成。

1.3總RNA提取

1.3.1細(xì)胞分離誘導(dǎo)提取總RNA使用無(wú)菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書分離淋巴細(xì)胞，加入含10%小牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液并吹勻，計(jì)數(shù)后稀釋至2×10⁶個(gè)/mL。用終濃度64mg/LConA刺激誘導(dǎo)，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞并按Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)其純度和濃度。

1.3.2細(xì)胞分離培養(yǎng)提取總RNA使用無(wú)菌注射器采取鵝翅靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書分離淋巴細(xì)胞，后將其重懸于含10%小牛血清的RPMI一1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)后稀釋至2×10⁶。個(gè)/mL，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按Trizol說(shuō)明書提取總RNA，通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)其純度和濃度。

1.3.3細(xì)胞分離直接提取總RNA使用無(wú)菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書分離淋巴細(xì)胞，用PBS重新懸浮，反復(fù)洗滌2～3次后按Trizol說(shuō)明書提取總RNA，通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)其純度和濃度。

1.3.4全血提取總RNA使用無(wú)菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按Trizol說(shuō)明書直接提取總RNA，通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)其純度和濃度。

1.4GoIFN-α基因的RT-PCR擴(kuò)增

GOIFN-α基因的反轉(zhuǎn)錄（RT）：取上述4種RNA懸浮液各5μL，參照反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書，均選用特異性引物R1分別合成cDNA第1鏈，RT產(chǎn)物各自標(biāo)記岳于20℃保存。

GolFN-α基因的PCR擴(kuò)增：取上述4種RT產(chǎn)物各2μL為cDNA模板，分別加入MixTaqDNA聚合酶25μL，上、下游引物（F1、R1）各1μL，超純水補(bǔ)足至各反應(yīng)體系均50μL，混勻后參照下列反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，28個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物各取5μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝皎電泳初步鑒定片段大小。

1.5Gol-α基因的克隆與鑒定

將上述4種經(jīng)凝皎電泳鑒定后的PCR產(chǎn)物用皎回收試劑盒純化回收，并分別與pGEMT-easy載體進(jìn)行連接，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5c～感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)，提取重組質(zhì)粒并作酶切鑒定。將陽(yáng)性GoLFN-α全基因重組質(zhì)粒送至上海立菲生物技術(shù)公司測(cè)序。

2.結(jié)果與分析

2.1總RNA純度與濃度測(cè)定

紫外分光光度儀分別測(cè)定4種不同方法提取的總RNA純度和濃度，結(jié)果見表1，其中D260nm/D280nm值反映總RNA的純度。

2.2GoLFN-α全基因的擴(kuò)增

對(duì)上述4種方法所得的揚(yáng)州鵝外周血總RNA，采用體積及反應(yīng)條件完全相同的反應(yīng)組分進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。之后在相同條件下進(jìn)行全長(zhǎng)GolFN-α基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均獲得了符合預(yù)期大小的約576bp的條帶（圖1）。endprint

2.3GoLFN-α全基因克隆與鑒定

將各PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體，分別用限制性內(nèi)切酶SalI或EcoRI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2（以細(xì)胞分離直接提取法所得GolFN-α基因重組為例），均出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-α。

2.4GolFN-α基因序列測(cè)定

將各種方法所對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒pGEMT-α>送至上海立菲生物技術(shù)公司測(cè)序，結(jié)果見表2-4種方法制備的GoLFN-α序列同源性為100.0%，與參考序列的同源性為99.7%。

3.結(jié)論與討論

本研究通過(guò)4種方法制備鵝外周血淋巴細(xì)胞總RNA并擴(kuò)增目的基因GolFN-α，結(jié)果顯示，各種方法所制備的總RNA均可擴(kuò)增出預(yù)期的目的基因，其中以“細(xì)胞分離直接提取法”所得總RNA濃度最高，同等條件下所得目的基因產(chǎn)量也最多。此結(jié)果提示我們：從外周血淋巴細(xì)胞中分離細(xì)胞因子，可以避開以往的細(xì)胞分離誘導(dǎo)提取法，改用無(wú)需誘導(dǎo)劑的細(xì)胞分離直接提取法，既高效又快捷，且能滿足后期的分子生物學(xué)研究。另外，全血提取法在不分離淋巴細(xì)胞的情況下直接提取，同樣獲得了目的基因，因此在對(duì)目的基因無(wú)產(chǎn)量要求的情況下全血提取法也是很好的選擇。

本研究中的全血提取法、細(xì)胞分離培養(yǎng)提取法及細(xì)胞分離直接提取法均未涉及到淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)，但卻成功獲得了目的基因，究其原因可能是所采鵝已受到外來(lái)病毒的感染，外周血淋巴細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為具有分化能力的淋巴母細(xì)胞，因此，分離的外周血細(xì)胞就算沒(méi)有刺激也可以達(dá)到預(yù)期目的。其中細(xì)胞分離直接提取法，淋巴細(xì)胞已從全血中分離出來(lái)卻又未經(jīng)培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞密度大、活性高，因此同等條件下總RNA和目的基因產(chǎn)量均最高。而全血提取法可能含其他細(xì)胞RNA量較多，故出現(xiàn)總RNA產(chǎn)量高、目的基因產(chǎn)量不高的局面。

本研究各種方法獲得的GolFN-α基因序列與GenBank中已發(fā)表的GolFN-α基因序列（登錄號(hào)：HQll5583）同源性達(dá)99.7%，說(shuō)明該基因相對(duì)保守，證實(shí)了禽IFN-α基因序列保守性良好、遺傳進(jìn)化變異緩慢的觀點(diǎn)。

綜上所述，細(xì)胞分離直接提取法可以替代甚至優(yōu)于之前常用的誘導(dǎo)法以實(shí)現(xiàn)畜禽細(xì)胞因子的分離擴(kuò)增；全血提取法操作簡(jiǎn)單，在對(duì)目的基因無(wú)產(chǎn)量要求的情況下也可運(yùn)用。endprint