王曄1,2，何宏輝11311,21,21,2，曾楠，謝軍，廖然，常金濤，孫明皓，馬輝

1. 清華大學 深圳研究生院，深圳市無損監(jiān)測與微創(chuàng)醫(yī)學技術(shù)重點實驗室，深圳 518055 2. 清華大學 物理系，北京 100084 3.海南大學 機電工程學院，?？?70228

*論著——生物醫(yī)學影像*

基于穆勒矩陣的偏振顯微鏡及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用

王曄1,2，何宏輝11311,21,21,2，曾楠，謝軍，廖然，常金濤，孫明皓，馬輝

1. 清華大學 深圳研究生院，深圳市無損監(jiān)測與微創(chuàng)醫(yī)學技術(shù)重點實驗室，深圳 518055 2. 清華大學 物理系，北京 100084 3.海南大學 機電工程學院，?？?70228

偏振光顯微鏡可用于觀察具有光學各向異性特征的樣品，因而在諸多領(lǐng)域都得到廣泛應(yīng)用，例如研究地質(zhì)巖石和礦物，分析壁畫顏料，檢驗紡織品和生物組織等。在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，偏振光顯微鏡能提供比普通光成像更豐富的微觀結(jié)構(gòu)信息，是一種有潛力的疾病診斷手段。然而在實際應(yīng)用中各向異性樣品的取向會對偏振測量產(chǎn)生一定影響。最近，我們設(shè)計了一種基于穆勒矩陣的全偏振顯微鏡，其主要依據(jù)穆勒矩陣雙波片旋轉(zhuǎn)測量方法[1]，通過在普通顯微鏡上添加起偏和檢偏裝置零件，利用計算機控制雙波片旋轉(zhuǎn)并定時采集圖像，最后處理圖像獲取被觀測樣品的穆勒矩陣。通過后續(xù)對所獲偏振圖像進行分解、變換等處理，我們可以減少樣品取向?qū)ζ駵y量產(chǎn)生的影響，更有效的獲取樣品微觀結(jié)構(gòu)信息?；谀吕站仃嚨娜耧@微鏡具有結(jié)構(gòu)簡單，測量快速，精度高等優(yōu)點，有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。文中將詳細介紹此種顯微鏡的原理，計算方法，誤差校準，并演示其在生物醫(yī)學樣品的測量結(jié)果。

偏振光，顯微鏡，穆勒矩陣

1　 裝置與原理

顯微鏡裝置如圖1所示，本文所使用的為透射式顯微鏡（科信L2000）。根據(jù)樣品的實際情況，還可采用反射式顯微鏡對厚樣品表面進行成像。加裝在顯微鏡光路中的起、檢偏模塊主要由一對偏振片和四分之一波片組成，其中起偏模塊由偏振片P1和四分之一波片R1組成一組偏振產(chǎn)生器P，檢偏模塊由偏振片P2和四分之一波片R2組成一組偏振分析器A。顯微鏡采用紅光LED作為光源（中心波長632 nm，帶寬50 nm），光源產(chǎn)生光強穩(wěn)定的光束經(jīng)過偏振產(chǎn)生器P，照射到載物臺的樣品上，經(jīng)過物鏡放大，最后經(jīng)過偏振分析器A分析其偏振態(tài)，并通過輔助鏡成像到 CCD（Qimaging RETIGA EXi，12位，696×520像素）上探測出其出射光的強度，CCD在特定位置獲取30幅偏振圖像，即可通過后續(xù)數(shù)據(jù)處理反推出被測樣品的穆勒矩陣。本文中實驗測量時固定起偏和檢偏模塊中的偏振片，并以1 :5的角度同步旋轉(zhuǎn)兩個四分之一波片來調(diào)制入射光和出射光的偏振態(tài)。穆勒矩陣是一種能完全描述樣品偏振光學屬性的表征方法，當我們使用一個四分量的斯托克斯矢量表示入射和出射光的偏振狀態(tài)時，介質(zhì)的偏振特征就可以通過4×4的穆勒矩陣表示。穆勒矩陣包含了樣品大量微觀結(jié)構(gòu)信息，由于能表征部分偏振光，因此斯托克斯矢量-穆勒矩陣表示法特別適合具有散射退偏效應(yīng)的生物組織成像分析[9]。

圖1　基于穆勒矩陣的全偏振顯微鏡實物圖及示意圖Fig.1　Full polarization microscope based on Mueller matrix method

2　 實驗測量與數(shù)據(jù)處理方法

2.1測量方案

本研究采用穆勒矩陣作為偏振顯微鏡測量方案。目前的穆勒矩陣測量方法主要有三種：直接測量法、半自動測量法、全自動測量法[10]。直接測量的原理主要是通過調(diào)整兩個四分之一波片的方位角，獲得16個以樣品穆勒矩陣的各元素為未知數(shù)的線性無關(guān)方程組，最終求解方程組獲得樣品穆勒矩陣。半自動測量法的原理是檢偏零件的四分之一波片R2每轉(zhuǎn)動一個方位后，使其固定，并以一定的角速度旋轉(zhuǎn)起偏零件的四分之一波片R1，同時探測器以一定的頻率接收光強。通過多次轉(zhuǎn)動波片R2，即可獲得一系列關(guān)于樣品穆勒矩陣各元素的線性方程組，最終由最小二乘法計算可獲得樣品的穆勒矩陣。這兩種方法的缺點是都需要手動調(diào)節(jié)波片旋轉(zhuǎn)，測量引入的誤差較大，測量所需的時間也較長。本文中采用的是全自動測量法，即雙波片旋轉(zhuǎn)穆勒矩陣測量法，它主要通過電腦控制，測量引入的誤差較小，且測量時間可以根據(jù)電機轉(zhuǎn)速和探測器的響應(yīng)周期調(diào)節(jié)，測量時間可以很短。本文所使用的顯微鏡裝置目前一次測量時間約為2分鐘。下面是雙波片旋轉(zhuǎn)測量方法[1]的主要工作原理：

由圖1可知出射光強表達式為：其中：Sin是入射光的斯托克斯矢量，MP1，MR1分別是起偏器件偏振片P1和四分之一波片R1的穆勒矩陣，

MP2，MR2分別是檢偏器件偏振片P2和四分之一波片R2的穆勒矩陣，Sout是入射光經(jīng)過樣品和檢偏器件后的斯托克斯矢量。

令起偏模塊矩陣為：

檢偏模塊矩陣為：

注射用血塞通對MCA粥樣硬化性血管狹窄伴MES陽性TIA患者MES和血脂水平的影響 …………… 史 敏等（4）：512

則

則得得：：

其中C=ωt， C' =5ωt 分別為兩個波片所轉(zhuǎn)的角度，那么依據(jù)傅里葉變換：

易知：Iout的傅里葉系數(shù)是樣品穆勒矩陣Msample中各個元素mij的線性函數(shù)，那么通過傅里葉變換即可獲得各系數(shù)an，bn，繼而通過解一系列的線性方程組可獲得樣品穆勒矩陣Msample中的所有元素。

2.2數(shù)據(jù)處理方法

在本文實驗中數(shù)據(jù)主要進行了穆勒矩陣分解處理。穆勒矩陣共有16個陣元，它包含了介質(zhì)的全部偏振信息，但穆勒矩陣元并沒有清晰的物理意義，需要經(jīng)過特定處理才能轉(zhuǎn)化為與微觀結(jié)構(gòu)存在對應(yīng)關(guān)系的偏振參數(shù)。對于穆勒矩陣的整體性研究比較復雜，各個陣元并非完全獨立，因而穆勒矩陣分解就顯得尤其重要，如果可以將穆勒矩陣分解為體現(xiàn)不同光學性質(zhì)的參數(shù)，將有利于對樣品偏振特性的定量分析。目前最為主流的穆勒矩陣分解方法是由Shih-yau Lu和Russell A. Chipman提出的極化分解方法（Mueller matrix polar decomposition）[11]。此方法依據(jù)偏振介質(zhì)傳輸?shù)娜齻€特性：二向色性（即與偏振有關(guān)的強度衰減性質(zhì)）、相位延遲（即與偏振有關(guān)的位相改變性質(zhì)）和散射退偏（即偏振光轉(zhuǎn)化為非偏振光的性質(zhì)），將穆勒矩陣分解為三個因子的乘積。通過分解得到的子矩陣可以獨立體現(xiàn)介質(zhì)的偏振特性。穆勒矩陣極化分解表達式如下：

式中所獲三個子矩陣分別為：

M△——樣品對于入射光的退偏振矩陣

MR——樣品對于入射光的位相延遲矩陣，

MD——樣品對于入射光的振幅雙向衰減矩陣，

m ——各個標準矩陣的 3×3階子矩陣。

2.3裝置校準

為了保證裝置測量結(jié)果的可靠性，我們首先對穆勒矩陣偏振顯微鏡進行了誤差分析和校準。根據(jù)圖1所示顯微鏡裝置結(jié)構(gòu)可知裝置誤差的可能來源主要有：光源、偏振器件、物鏡、輔助鏡、CCD以及裝置本身其他未知因素。為了消除不同誤差來源對成像結(jié)果造成的影響，我們首先對裝置進行了校準，即測量偏振性質(zhì)已知的樣品。圖2所示為對空氣進行測量獲得的穆勒矩陣Mair，理論上空氣的穆勒矩陣應(yīng)為單位矩陣，通過比較實際測量值和理論值我們可獲得系統(tǒng)的誤差矩陣M'，得I=M’Mair。由此經(jīng)過校準后的樣品穆勒矩陣如下式：

式中Mcorrect為樣品真實穆勒矩陣為系統(tǒng)裝置誤差校準矩陣，Mcorrect為裝置實際測量的樣品穆勒矩陣。

圖2 （a）校準前的空氣穆勒矩陣（b）校準后的空氣穆勒矩陣Fig.2　Mueller matrix of air

圖2顯示了偏振顯微鏡測量空氣穆勒矩陣校準前與校準后的結(jié)果，可以看到校準后，空氣測量結(jié)果更為接近單位矩陣，其各個陣元測量誤差在1% 以下，上述結(jié)果表明經(jīng)過誤差校準后的穆勒矩陣偏振顯微鏡測量結(jié)果是可靠的。

3　 實驗結(jié)果與分析

在進行了誤差校準后，我們選擇了一些有代表性的樣品進行穆勒矩陣顯微成像，本節(jié)將展示藻類細胞、人體癌變組織等的成像效果，并進行分析。

3.1藻類

近年來藻類污染已成為一個全球性問題，對水體中藻類等微生物進行分類具有非常重要的生物學意義[12,13]，本文選取了一種藻類-三角褐指藻進行顯微成像，以顯示偏振方法進行藻類形態(tài)鑒別的潛力。圖3為100倍物鏡觀測下藻懸浮液某區(qū)域單個三角褐指藻的穆勒矩陣分解所獲的散射退偏參數(shù)圖，圖4為100倍物鏡觀測下藻懸浮液某區(qū)域多個三角褐指藻堆積的穆勒矩陣分解所獲的散射退偏參數(shù)圖。從圖3及圖4中可看到三角褐指藻的輪廓與內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異所導致的散射退偏值差異，表明散射退偏可獲取藻類樣品的邊界及微觀結(jié)構(gòu)信息。

圖3　單個三角褐指藻散射退偏參數(shù)圖（100X）Fig.3　Depolarization of single Phaeodactylum tricornutum

圖4　多個三角褐指藻散射退偏參數(shù)圖（100X）Fig.4　Depolarization of multiple Phaeodactylum tricornutum

圖5　厚度為28μm無染色的宮頸鱗狀上皮癌切片的穆勒矩陣分解參數(shù)圖，紅色虛線區(qū)域大致為癌變區(qū)域（a）二向色性參數(shù)圖（b）散射退偏參數(shù)圖（c）線性相位延遲參數(shù)圖(4X)Fig.5　Mueller matrix polar decomposition imaging results of cervical cancer tissue

圖6　厚度為28μm無染色的甲狀腺癌切片的穆勒矩陣分解參數(shù)圖，紅色虛線區(qū)域大致為癌變區(qū)域（a）二向色性參數(shù)圖（b）散射退偏參數(shù)圖（c）線性相位延遲參數(shù)圖(4X)Fig.6　Mueller matrix polar decomposition imaging results of thyroid cancer tissue

3.2癌變組織

近年來惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升，成為人類健康的最大威脅之一。上世紀90年代有學者開始嘗試將偏振方法應(yīng)用于癌癥的診斷[14-16]，由于癌癥早期大多起源于淺表組織，偏振光成像方法能有效提高淺層組織的成像質(zhì)量，因此偏振方法具有成為癌癥早期檢測手段的潛力。最近偏振光成像方法已被初步用于腸癌、宮頸癌、甲狀腺癌、皮膚癌等的檢測，本文選擇了兩組有代表性的癌組織切片作為樣品，進行反射式顯微成像。圖5所示為4倍物鏡觀測下未經(jīng)染色處理的甲狀腺癌切片的穆勒矩陣分解參數(shù)圖，圖6所示為4倍物鏡觀測下未經(jīng)染色處理的宮頸鱗狀上皮癌切片穆勒矩陣分解參數(shù)圖，圖中紅色虛線標識的區(qū)域大致為癌變區(qū)域。從圖5（c）可以看到，樣品的線性相位延遲參數(shù)值整體較小，基本趨近于0，而左下有一小塊區(qū)域的值明顯比其他區(qū)域偏大。根據(jù)對相應(yīng)染色切片進行的病理學診斷可知，該樣品絕大部分為宮頸鱗狀上皮癌組織，只有左側(cè)一小區(qū)域為正常的宮頸組織，這與其線性相位延遲的區(qū)域分布特征吻合，表明宮頸癌的癌變區(qū)域線性相位延遲值小于正常區(qū)域數(shù)值。圖6（a）和（b）顯示了甲狀腺癌組織切片癌變區(qū)域的二向色性參數(shù)值明顯大于正常組織區(qū)域的數(shù)值，而癌變區(qū)域的散射退偏參數(shù)值則明顯小于正常區(qū)域的數(shù)值。圖5及圖6表明穆勒矩陣分解參數(shù)能很好地區(qū)分部分癌變和正常組織。近期相關(guān)研究結(jié)果已顯示，穆勒矩陣元以及變換參數(shù)同樣具有癌變等病變檢測的潛力[17]。

圖3-圖6所示的實驗結(jié)果表明：利用基于穆勒矩陣的全偏振顯微鏡可以獲取樣品大量的結(jié)構(gòu)信息，包括樣品的散射退偏、二向色性、相位延遲等參數(shù)，從中可獲取生物組織的病理變化特征，具有癌癥檢測的潛力。除此之外，通過對穆勒矩陣進行更全面的變換處理，我們還可以獲得樣品的各向異性、角度取向等信息[18]，以應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究。

5　 結(jié) 論

本文基于雙波片旋轉(zhuǎn)穆勒矩陣測量法發(fā)展了一種全偏振顯微鏡，并介紹了裝置結(jié)構(gòu)，測量方法和數(shù)據(jù)處理方法。通過對偏振顯微鏡進行誤差校準，裝置的測量誤差可達到1% 以下。通過對生物組織等進行穆勒矩陣成像，我們驗證了偏振穆勒顯微鏡裝置的可靠性，并發(fā)現(xiàn)可以通過偏振穆勒顯微鏡獲取多種樣品的結(jié)構(gòu)信息與光學特性。由于基于穆勒矩陣的偏振顯微鏡具有測量快速、無損、獲得的信息量豐富的優(yōu)點，且成本較為低廉，因此其具有廣泛的生物醫(yī)學應(yīng)用前景。

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Polarized Light Microscopy Based On Mueller Matrix and its Applications on Biomedical Studies

WANG Ye1,2, HE Honghui1, ZENG Nan1, XIE Jun3, LIAO Ran1, CHANG Jintao1,2, SUN Minghao1,2, MA Hui1,2*
Shenzhen Key Laboratory for Minimal Invasive Medical Technologies, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China Department of Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China Mechanical and Electrical Engineering College, Hainan University, Haikou 570228, China

Polarized light microscopy is widely used in observation of optical anisotropic characteristics of samples. It has been applied to the studies in many fi elds, such as the geology of rocks and minerals, analysis of mural pigment, inspection of textiles, and detection of biological tissues. In biomedical studies, polarized light microscopy can provide rich micro structural information, which can be useful for the detection of abnormal tissues. However, the orientation distribution of anisotropic samples can infl uence the polarization measurement. Recently, we designed a new type of polarized light microscopy based on Mueller matrix imaging method. In this microscopy all the elements of the Mueller matrix are simultaneously determined from the analysis in the frequency domain of the time-dependent intensity of the light beam at every pixel of the camera. The variations in intensity are created by thetwo compensators continuously rotating at different angular frequencies. Through the subsequent transformation processing of the received polarization image, we can reduce the influence of sample orientation on polarization measurement and obtain the micro structural information more effectively. With the advantages of simple structure, rapid measurement and high precision, polarized light microscopy based on Mueller matrix shows a good development prospect.

polarized light; microscopy; Mueller matrix

R730.58

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.01.13

2015-02-09；

2015-03-15

王曄，碩士研究生，研究方向為偏振散射方法在生物醫(yī)學方面的應(yīng)用，電子信箱：ye-wang13@mails.tsinghua.edu.cn；馬輝(通信作者)，教授，博士生導師，主要研究方向包括偏振光散射理論、方法和應(yīng)用、光學相干斷層成像等生物醫(yī)學光學方法，電子信箱：mahui@mail.tsinghua.edu.cn

引用格式：王曄，何宏輝，曾楠,等. 基于穆勒矩陣的偏振顯微鏡及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用 [j].世界復合醫(yī)學.2015,1（1）74—78.