文 / 尉冬梅，徐 軍，董豐收，劉新剛，吳小虎，鄭永權

（1．農業(yè)部農產品質量安全生物性危害因子風險評估實驗室，中國農業(yè)科學院 植物保護研究所，北京，100193；

2．沈陽農業(yè)大學 植物保護學院，沈陽 110161）

芒果及番木瓜炭疽病菌在病斑外延組織中的分布檢測

文 / 尉冬梅12，徐 軍1，董豐收1，劉新剛1，吳小虎1，鄭永權1

（1．農業(yè)部農產品質量安全生物性危害因子風險評估實驗室，中國農業(yè)科學院 植物保護研究所，北京，100193；

2．沈陽農業(yè)大學 植物保護學院，沈陽 110161）

為評估芒果和番木瓜感染炭疽病后的食用安全性，本文研究了膠孢炭疽菌在不同病斑大小的芒果和番木瓜中的擴散范圍。以芒果、番木瓜及膠孢炭疽菌為實驗材料，采用人工接菌的方法，對不等病斑大小時，病斑外延不等距離處的外延組織進行檢測。結果表明，當芒果病斑直徑大小為0.5cm，1cm，2cm時，在病斑及病斑外延1cm處可檢測到膠孢炭疽菌菌落；當病斑直徑為3cm時，病斑處及其外延2cm范圍內可檢測到膠孢炭疽菌菌落。當番木瓜病斑直徑大小為0.5cm，1cm，2cm，3cm時均在病斑及病斑外延1cm處可檢測到膠孢炭疽菌菌落，病斑外延1cm以外，未檢測到膠孢炭疽菌菌落。

芒果；番木瓜；膠孢炭疽菌；分布檢測

芒果、番木瓜均屬熱帶水果，在我國主要分布在海南、云南、廣東、廣西、福建等省。芒果汁多肉嫩、酸甜可口、營養(yǎng)豐富，享有“熱帶果王”的美譽[1]，深受廣大消費者的喜愛。番木瓜，與香蕉、菠蘿并稱“熱帶三大草木果樹”[2]，果肉味甜而清香，具有豐富的營養(yǎng)，是制作果脯蜜餞、果汁、罐頭、果醬、果凍、水果糖、冰激凌等理想的營養(yǎng)保健品原料，也可制成各種方便快捷食品。

炭疽病是世界范圍內農業(yè)生產中發(fā)生最為普遍的病害之一，熱帶地區(qū)因為氣溫偏高，雨水充沛，濕度較大，炭疽病發(fā)生尤為嚴重。炭疽病是危害芒果和番木瓜的較為嚴重的真菌病害[3-6]，大多數(shù)由膠孢炭疽菌[7]引起，少數(shù)為辣椒炭疽菌。該病菌可引起芒果花、葉和果實的脫落，其潛伏菌使采后果實變黑腐爛，嚴重影響果實的產量和品質，大大縮短商品芒果的貨架期[8,9]；可侵染番木瓜葉、莖和果實，是造成番木瓜田間和貯藏期果實腐爛的主要原因之一[10,11]。由于膠孢炭疽菌的潛伏浸染性，往往在采后儲藏及運輸時大爆發(fā)。有研究表明，不同寄主上分離的菌株可交叉侵染[12]。雖然對膠孢炭疽菌的生物學特性[13-15]，水果采后保鮮及炭疽病生物防治[6,16-18]，化學藥劑的篩選[19]已有相關報道，但由于芒果及番木瓜個體較大，當表面出現(xiàn)病斑后可剔除病斑及其外延相應范圍后繼續(xù)食用或用于生產加工制品，有關炭疽菌在病斑外延組織中的擴散分布情況尚未見報道。當芒果、番木瓜被病原菌侵染后繼續(xù)存放時，病原菌會從腐爛部分向未腐爛部分滲透擴散，導致表面看似健康的部分同樣含有病原菌，然而通過簡單的剔除腐爛斑處，不能有效控制病原菌直接被食用，或進入加工流程，帶來后續(xù)隱患。為了明確芒果、番木瓜染炭疽菌后病斑大小不同時，炭疽菌在外延組織中的擴散情況，以及比較該兩種不同水果基質中的擴散情況差異，進行本試驗，以期為安全食用提供科學建議，為其風險情況做出評估。

1、材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果、番木瓜均為市售大小適中，成熟度一致，無損傷，無病害。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由廣東農業(yè)科學院植物保護研究所提供。PDA培養(yǎng)基，鏈霉素硫酸鹽、利福平（Sigma公司），75%酒精等。超凈工作臺（北京亞太科隆有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設備廠），XW-80A 渦混合器（美國Scientific industries公司），智能人工氣候培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠），天平（賽多利斯)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將保存的膠孢炭疽菌轉接到PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7d。

1.2.2 水果清洗及接種：清水浸泡芒果及番木瓜3m in，隨后清水沖洗，再用75%的酒精棉擦拭水果表面以初步滅菌。在無菌操作條件下，將活化后的膠孢炭疽菌用無菌水配置成菌懸液，采用人工接菌的方法，在芒果及番木瓜的中間偏上部位致“十字形”傷口，用移液槍將菌懸液注入傷口處50μ L，溫度為25℃，濕度為90%條件下培養(yǎng)[20]。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m l。將洗凈后去皮的馬鈴薯切成小塊，加水煮沸約30m in，用紗布過濾，加水補足1000m l，加葡萄糖和瓊脂，加熱使瓊脂完全融化后分裝，每瓶200m l，121℃下高壓蒸汽滅菌30m in。對芒果樣品病原菌擴散測定時，稱取鏈霉素硫酸鹽100m g溶于1m L無菌水中配成100m g/m l的母液，培養(yǎng)基稍涼至40℃左右時，加入上述配制好的鏈霉素硫酸鹽母液,每瓶培養(yǎng)基加鏈霉素硫酸鹽200μ L，使鏈霉素硫酸鹽在培養(yǎng)基中的濃度為100μ g/m l[21]。番木瓜樣品病原菌擴散測定時將鏈霉素硫酸鹽替換成福利平，使用濃度及配制方法同鏈霉素硫酸鹽。

1.2.4 取樣及樣品稀釋：待病斑直徑長至0.5cm、1cm、2cm、3cm時,分別取3個芒果、番木瓜進行取樣。當病斑直徑為0.5cm及1cm時，取樣范圍為：腐爛斑處、腐爛斑外延1 cm處、2 cm處、3cm處；當病斑直徑2cm、3cm時，取樣范圍擴大至病斑外延4cm處。在無菌操作條件下，取樣果皮及果肉，取樣大小為1×1×1cm 3，用眼科剪和手術剪將果肉剪碎，加適量無菌水稀釋制成1∶10（V/V）樣品液，渦旋3 m in，取0.5m l 1∶10稀釋液注入含有4.5m l無菌水的離心管中，另換一支1m l無菌吸管反復吹吸，此液為1∶100稀釋液，按上述操作方法制備1∶1000稀釋液[18]。

1.2.5 培養(yǎng)與記錄 每個稀釋度分別吸取1m l樣品勻液于2個無菌平皿內，接種無菌水作為空白對照，另外做健康芒果及番木瓜的3個濃度的對照，及時將上述配制好含鏈霉素硫酸鹽或利福平15-20m l冷卻的PDA培養(yǎng)基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后，將平板倒置，在溫度為25℃±1℃，濕度為90%的條件下進行培養(yǎng)，芒果樣品稀釋液培養(yǎng)3d，木瓜樣品稀釋液培養(yǎng)5d，觀察并記錄是否有菌落生長。

2、結果與分析

在抗生素的選擇上，培養(yǎng)芒果樣品稀釋液時，100μ g/m l鏈霉素硫酸鹽可抑制細菌生長。但在培養(yǎng)番木瓜樣品稀釋液時，使用鏈霉素硫酸鹽仍有雜菌干擾，經驗證100μ g/m l利福平可達到抑制細菌效果。所以，在檢測芒果炭疽病斑外延組織中炭疽菌的分布時選用鏈霉素硫酸鹽，在檢測番木瓜炭疽菌病斑外延組織中炭疽菌的分布時選用利福平。

經過培養(yǎng)觀察,檢測結果如表1、表2所示，相同病斑大小時取3個芒果或番木瓜，取樣后每個樣品稀釋液接種于兩個培養(yǎng)皿中，相當于不同病斑大小外延不等距離處共6個平行。當芒果炭疽病病斑為0.5cm，1cm，2cm時，在病斑及其外延1cm范圍內都檢測到炭疽菌，當病斑為3cm時，在其外延2cm范圍內可檢測到炭疽菌。當番木瓜炭疽病病斑為0.5cm，1cm，2cm，3cm時，在病斑及其外延1cm范圍內可檢測到炭疽菌。該范圍外及對照均無菌落生長。

同種水果，隨著病斑直徑增大，污染范圍增長并不明顯。只有芒果病斑直徑擴大至3cm時，污染范圍擴大至病斑外延2cm，在病斑直徑不大于2cm時，污染范圍均在病斑外延1cm之內。番木瓜炭疽病斑從0.5cm擴大至3cm時，污染范圍均在病斑外延1cm之內。兩種水果相比較，炭疽菌的擴展范圍基本一致，只有當病斑較大時（直徑大于3cm），芒果病斑外延的污染范圍要大于番木瓜。

表1 芒果不同病斑大小及病斑外延不同距離的炭疽菌菌落的檢測結果

表2 番木瓜不同病斑大小及病斑外延不同距離的炭疽菌菌落的檢測結果

3、結論

感染炭疽病的芒果及番木瓜中，炭疽菌已擴散一定范圍，在直接食用或加工過程中，僅僅剔除腐爛斑處，并不能有效防止炭疽菌被食用，或進入加工流程對加工制品品質帶來影響，所以建議當芒果腐爛斑不超過2cm時，剔除腐爛斑及其外延1cm，剩余部分可用；當病斑為2至3cm時，剔除病斑及其外延2cm，剩余部分可用。當番木瓜腐爛斑不超過3cm時，剔除腐爛斑及其外延1cm，剩余部分可用。

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國家農產品質量安全風險評估項目（GJFP2015014）