李 宏，李德華，胡 波

（1.遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121000；2.撫順市第四醫(yī)院，遼寧 撫順 113000）

乳腺癌以23%的女性惡性腫瘤占有率成為近年來惡性腫瘤增長幅度最大的腫瘤，且呈年輕化趨勢[1]。乳腺彩色多普勒超聲檢查是乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的基礎方法。隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后與多種基因蛋白的突變和異常表達相關。Ki67、p53等生物學指標在乳腺癌病情發(fā)展、治療和預后的判斷有重要的臨床價值。

國內(nèi)外文獻報道，Ki67是核增殖相關蛋白，能有效評估腫瘤細胞增殖活性[2-3]。Ki67的表達是乳腺癌研究的重要指標，其表達的高低反映腫瘤細胞的增殖情況，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等方面顯著相關[4-5]。p53是腫瘤中最易發(fā)生突變的抑癌基因，分野生型和突變型。野生型p53通過提高DNA修復能力抑制細胞增殖及分化。突變型失去正常抑癌作用，促進細胞惡性轉(zhuǎn)化而誘發(fā)腫瘤。研究表明，p53在正常乳腺組織不表達，而在乳腺癌組織中過度表達，p53是乳腺癌分期、分級和病理分型的獨立預測指標[6]。目前，臨床主要通過術后組織活檢標本的免疫組化染色來判定Ki67、p53的表達，本文旨在通過術前的非侵襲性超聲影像學方法預測及評估Ki67、p53的表達，進而分析超聲征象與Ki67、p53表達的相關性，為乳腺癌非手術治療、術前及術后風險評估提供指導依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集遼寧省撫順市第四醫(yī)院2013年12月—2014年6月保存的乳腺癌患者術后標本135例，均經(jīng)病理檢查確診，資料完整?；颊呔鶠榕裕挲g23～78 歲，平均年齡（45.28±8.71）歲，中位年齡 46歲。所有病例術前均行彩色多普勒超聲檢查，未行放療、化療及內(nèi)分泌治療。術后對腫瘤標本進行Ki67、p53免疫組化指標檢測。

1.2 儀器及方法

應用美國GE公司Logiq P6彩色多普勒超聲診斷儀，探頭為11L。檢查時患者仰臥，使用高頻探頭經(jīng)體表直接檢查，首先檢查乳腺，最后檢查腋窩，觀察有無腫大淋巴結及其形態(tài)改變、血流情況。發(fā)現(xiàn)腫塊時記錄其聲像圖特征，重點記錄腫塊大小、邊緣、形態(tài)，鈣化的分布、形態(tài)，腫塊邊界是否清晰、周邊血流分布及有無淋巴結轉(zhuǎn)移情況。彩色血流顯像分級按Adler血流分級法，為0～1級和2～3級。

1.3 主要試劑

兔抗人Ki67單克隆抗體SP6，兔抗人p53單克隆抗體SP5，檸檬酸鹽抗原修復液（pH=6.0），Elivison二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。其余試劑均由遼寧醫(yī)學院科研實驗中心提供。

1.4 免疫組織化學方法

采用免疫組化方法檢測組織Ki67、p53的表達。組織標本用10%福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備5 μm厚連續(xù)切片，60℃烤片3 h。免疫組化染色：①石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟。②對組織抗原進行高壓熱修復（220℃，2 min）：檸檬酸抗原修復液（0.01 M，pH6.0）。③3%H2O2室溫下孵育 10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗3次（5 min/次）。④滴加一抗：Ki67、p53均采用即用型工作液。室溫孵育60 min，PBS沖洗3次（5 min/次）。⑤滴加試劑：滴加聚合物增強劑（試劑A），孵育20 min，PBS沖洗后滴加酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物（試劑B），孵育30 min。⑥滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色滿意后終止反應。⑦蒸餾水沖洗，蘇木素復染3～5 min，1%鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗30 min。⑧梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。每次以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.5 判定標準

隨機選取10個高倍視野，計數(shù)每個視野中的陽性細胞，并取平均值。Ki67、p53的表達以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。根據(jù)切片所選視野中陽性細胞占全部細胞的比例將其分為：陽性＜10%為陰性（-），10%～25%為（+），26%～50%為（++），≥51%為（+++）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，運用χ2檢驗和Spearman秩相關檢驗。分析結果以差異P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 超聲征象特征

超聲影像顯示：135例患者中，42例腫塊＜2 cm，93例腫塊≥2 cm；78例腫塊邊緣有毛刺；50例腫塊呈不規(guī)則形，36例呈分葉狀，49例呈類圓形。107例患者鈣化，36例散在分布，44例簇狀分布，27例沿導管走向；鈣化形態(tài)以細沙狀為主，占53例；血流顯像分級以2～3級為主，占102例；63例淋巴結轉(zhuǎn)移；41例侵犯周圍組織，見圖1。

2.2 Ki67、p53在乳腺癌中的表達

在135例乳腺癌組織中，Ki67有87例表達陽性，陽性率64.4%（87/135），p53有69例表達陽性，陽性率 51.1%（69/135），見圖2，3。

2.3 Ki67、p53的表達與超聲征象的關系

圖1 彩色多普勒超聲征象。圖1a：59歲，乳房腫瘤4.5 cm×2.6 cm，形態(tài)不規(guī)則。圖1b：40歲，乳房腫瘤形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)伴多發(fā)鈣化。圖1c：59歲，乳房腫瘤形態(tài)不規(guī)則，血流信號豐富。圖1d：56歲，腋下淋巴結轉(zhuǎn)移。Figure 1. Color Doppler ultrasonography.Figure 1a:59 years old,breast tumor by 4.5 cm×2.6 cm with an irregular shape.Figure 1b:40 years old,breast tumor with an irregular shape and multiple calcification.Figure 1c:59 years old,breast tumor with an irregular shape and rich blood flow signal.Figure 1d:56 years old,with axillary lymph node metastasis.

圖2 乳腺癌組織中 Ki67 的表達。圖2a：陰性（-）；圖2b～2d：Ki67 陽性表達于細胞核，圖2b：（+），圖2c：（++），圖2d：（+++）。Figure 2. The expression of Ki67 in breast cancer.Figure 2a:negative(-);Figure 2b～2d:Positive expression of Ki67 in the nucleus,Figure 2b:(+),Figure 2c:(++),Figure 2d:(+++).

圖3 乳腺癌組織中 p53 的表達。圖3a：陰性（-）；圖3b～3d：p53 陽性表達于細胞核，圖3b：（+），圖3c：（++），圖3d：（+++）。Figure 3. The expression of p53 in breast cancer.Figure 3a:negative(-);Figure 3b～3d:Positive expression of p53 in the nucleus,Figure 3b:(+),Figure 3c:(++),Figure 3d:(+++).

Ki67、p53表達與血流顯像分級，淋巴結轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織有顯著性相關（P＜0.05），可見 Ki67、p53表達水平增高，血流顯像分級越高，淋巴結轉(zhuǎn)移機會越大，侵犯周圍組織的可能性也越大。Ki67與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)有顯著相關性（P＜0.05），與鈣化分布無相關性（P＞0.05），而p53與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)無相關性（P＞0.05），與鈣化分布有顯著性相關（P＜0.05），可見 Ki67、p53在腫塊形態(tài)、鈣化分布、鈣化形態(tài)方面表達的相關性上有差異。Ki67、p53表達與腫塊大小、腫塊邊緣無相關性（P＞0.05）。見表1。

表1 乳腺癌Ki67、p53表達與超聲征象的關系

2.3 Ki67表達與p53表達的關系

Ki67與p53表達程度呈正相關（r=0.617，P＜0.05），見表2。

3 討論

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是由多基因、多因素突變的結果。在乳腺組織癌變的進程中，相關基因Ki67、p53表達的改變從不同層面反映了乳腺癌的惡性程度及組織病理學改變，從而形成了多種影像學表現(xiàn)。Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，反映早期乳腺癌細胞增殖狀態(tài)，其表達率增高，提示乳腺癌細胞的惡性程度大，腫瘤生長速度快，侵襲力強，發(fā)生轉(zhuǎn)移較早，預后差，是指導乳腺癌早期診斷及評價預后的理想指標[7]。Sasano[7]研究表明Ki67表達水平反映腫瘤細胞的活性，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后顯著相關。p53分野生型和突變型，突變型p53幾乎表達于所有的惡性腫瘤中，乳腺癌中有20%～60%p53基因發(fā)生突變。p53過度表達或突變會增加乳腺正常組織及良性病變向乳腺癌發(fā)展的風險。Kobayashi等[8]研究報道，p53細胞增殖指數(shù)和突變率低，應與Ki67聯(lián)檢來區(qū)分乳腺癌類型。本實驗通過對乳腺癌患者聯(lián)檢Ki67、p53組織病理學形態(tài)改變，分析其與乳腺癌超聲影像征象之間存在的關聯(lián)性。

表2 乳腺癌組織中Ki67、p53表達的關系

本實驗結果顯示，Ki67陽性率64.4%，p53陽性率51.1%。彩色多普勒超聲顯示Ki67、p53表達與腫塊大小、腫塊邊緣無相關性。Ki67、p53的表達在血流顯像分級（2～3級），淋巴結轉(zhuǎn)移陽性及侵犯周圍組織的病例中較血流顯像分級（0～1級），淋巴結轉(zhuǎn)移陰性及腫瘤未侵犯周圍組織的病例明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學意義。超聲顯像提示血流顯像分級越高，血流越豐富，淋巴結轉(zhuǎn)移機會越多，侵犯周圍組織的可能性也越大，此結果表明Ki67、p53的陽性表達與血流顯像分級，淋巴結轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織呈顯著性相關，這與Ki67、p53高表達水平可提示腫瘤惡性程度較高相一致。de Azambuja等[9]對文獻進行Meta分析，發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌淋巴結轉(zhuǎn)移者Ki67高表達比例增加，預后差，提示Ki67可促進腫瘤轉(zhuǎn)移并造成不良預后。Vincent-Salomon等[10]，Kerlikowske等[11]研究結果顯示在乳腺原位癌、乳腺浸潤性導管癌中Ki67和p53高表達，可作為乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移及預后復發(fā)的高風險生物標志物。本研究顯示Ki67與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)顯著性相關，與鈣化分布無相關性，類圓形腫塊Ki67的陽性表達率（79.6%）高于不規(guī)則形（62.0%）和分葉狀（47.2%），桿狀鈣化Ki67的陽性表達率（81.8%）顯著高于細沙狀鈣化（67.9%）和顆粒狀鈣化（47.6%），由此推斷超聲表現(xiàn)為類圓形腫塊及桿狀鈣化的乳腺癌，其組織結構紊亂，增殖指數(shù)及惡性程度高，預后較差。而p53與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)無相關性，與鈣化分布有顯著性相關，p53的陽性表達率在沿導管走向的鈣化分布（74.1%）明顯高于散在分布（41.7%）和簇狀分布（52.3%），提示超聲表現(xiàn)為鈣化沿導管走向的乳腺癌組織壞死越明顯，越容易導致鈣化，其惡性程度越高。可見Ki67、p53在腫塊形態(tài)、鈣化分布、鈣化形態(tài)方面表達的相關性上存在差異，但未見相關文獻報道，還需進一步研究予以證實。Ki67與p53表達呈正相關，說明兩者在腫瘤生長進程中起相互協(xié)同和調(diào)節(jié)的作用。在乳腺癌的研究中，Ki67與p53聯(lián)檢可以相互補充、相互印證，較充分的評估乳腺癌的惡性程度及預后效果。

綜上所述，超聲征象能清楚顯示乳腺癌的形態(tài)學改變，是乳腺癌早期檢查的可靠方法。而Ki67、p53表達能從組織學方面反映乳腺癌的生物學變化。乳腺癌超聲征象與Ki67、p53表達之間具有一定的內(nèi)在關聯(lián)。超聲征象從一定程度上體現(xiàn)Ki67、p53的表達情況，可作為預測乳腺癌患者Ki67、p53表達水平的無創(chuàng)性手段，進而為乳腺癌非手術治療、術前診斷及預后評估提供指導依據(jù)。

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Sundov D,Caric A,Mrklic I.P53,MAPK,topoisomeraseⅡalpha and Ki67 immunohistochemical expression and KRAS/BRAF mutation in ovarian serous carcinomas[J].Diagn Pathol,2013,6(8):21-29.

[3]Wang L,Feng C,Ding G,et al.Ki67 and TP53 expressions predict recurrence of non-muscle-invasive bladder cancer[J].Tumour Biol,2014,35(4):2989-2995.

[4]Nishimura R,Osako T,Okumura Y,et al.Clinical significance of Ki-67 in neoadjuvant chemotherapy for primary breast cancer as a predictor for chemosensitivity and for prognosis[J].Breast Cancer,2010,17(5):269-275.

[5]Stuart-Harris R,Caldas C,Pinder SE,et al.Proliferation makers and survival in early breast cancer:a systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32825 patients[J].Breast Cancer,2008,17(14):323-334.

[6]Rohan TE,Li SQ,Hartwick R,et al.P53 alterations and protein accumulation in benign breast tissue and breast cancer risk:a cohort study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15(7):1316-1323.

[7]Sasano H.Histopathological prognostic factors in early breast carcinoma:an evaluation of cell proliferation in carcinoma cells[J].Expert Opin Invest Drugs,2010,19(1):5-11.

[8]Kobayashi T,Iwaya K,Moriya T,et al.A simple immunohistochemical panel comprising 2 conventional marker,Ki67 and p53,is a powerful tool for predicting patient outcome in luminal-type breast cancer[J].BMC Clin Pathol,2013,13(5):125-134.

[9]de Azambuja E,Cardoso F,de Castro G Jr,et al.Ki67 as prognostic marker in early breast cancer:a meta-analysis of published studies involving 12155 patients[J].Br J Cancer,2007,96(10):1504-1513.

[10]Vincent-Salomon A,Hajage D,Rouquette A,et al.High Ki67 expression is a risk marker of invasive relapse for classical lobular carcinoma in situ patients[J].Breast,2012,21(3):380-383.

[11]Kerlikowske K,Molinaro AM,Gauthier ML,et al.Biomarker expression and risk of subsequent tumors after initial ductal carcinoma in situ diagnosis[J].J Natl Cancer Inst,2010,102(9):627-637.