滕小梅　Md Abdur Rob Rayhan 劉廷興　沈振亞★

·實驗研究·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺血培養(yǎng)上清細(xì)胞因子分析

滕小梅Md Abdur Rob Rayhan 劉廷興沈振亞★

目的 研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血條件下分泌的細(xì)胞因子濃度變化。方法 用全骨髓差異貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），取第3代細(xì)胞進行實驗。實驗分兩組：A組提取正常培養(yǎng)細(xì)胞的上清液；B組將細(xì)胞置于無血清的培養(yǎng)基中24h后，提取上清液。采用蛋白分析技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中27種細(xì)胞因子變化情況。結(jié)果 無血清細(xì)胞培養(yǎng)組中ICAM-1、IFN-γ和IL-10的濃度與有血清的細(xì)胞培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血條件下分泌的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)生變化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 缺血培養(yǎng) 細(xì)胞因子

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）改善心功能的研究已成為國際研究熱點，但細(xì)胞移植改善心臟功能的機制仍存在許多爭議，目前主要認(rèn)為干細(xì)胞的旁分泌機制發(fā)揮主要作用，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子抑制細(xì)胞凋亡，促使心臟毛細(xì)血管生長，改善衰竭心肌血供，抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷。作者自2014年1月至7月分別應(yīng)用有血清和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC，研究其分泌的細(xì)胞因子差異，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在急性缺血環(huán)境下的旁分泌作用。

1　材料和方法

1.1材料 健康8周齡清潔級SD大鼠10只，均從中國科學(xué)院實驗動物中心購買，之后均按照GLP于蘇州大學(xué)心血管病研究所實驗室動物房進行喂養(yǎng)和觀察。低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）、QAR-CYT-3芯片（Raybiotech）。

1.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的培養(yǎng)及鑒定 通過全骨髓培養(yǎng)方法，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面分子CD29、CD90、CD73、CD11b的表達(dá)。

1.3MSC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子分析 A組：收集第三代MSC在10%FBS的培養(yǎng)基的上清液，B組：收集第三代MSC在無血清培養(yǎng)基中24h后上清液，應(yīng)用蛋白分析芯片QAR-CYT-3，按照Raybiotech公司的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行，檢測27種大鼠細(xì)胞因子：B7-2、b-NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFN-γ、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、LIX、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNFα、VEGF。芯片結(jié)果采用GenePix4000B進行掃描，用軟件GenePix Pro 6.0讀取原始數(shù)據(jù)，使用標(biāo)準(zhǔn)分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計算各樣品的濃度。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 P0代細(xì)胞在1～2d即開始有少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)呈現(xiàn)紡錘狀、多角形。P1代以后細(xì)胞生長迅速，2h后開始貼壁，細(xì)胞以集落生長的形式為主。細(xì)胞整體排列呈漩渦狀、輻射狀或魚群樣排列。取P3進行實驗，根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，顯示BMSCs超過90%表達(dá)CD29及CD90，但不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34及CD4。

2.2MSC條件培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的檢測 采用蛋白分析芯片法測定MSC在有血清和無血清條件培養(yǎng)下分泌的細(xì)胞因子，結(jié)果顯示無血清細(xì)胞培養(yǎng)組中ICAM-1、IFN-γ和IL-10的濃度與有血清的細(xì)胞培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1，其它細(xì)胞因子濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　兩組培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的濃度［只，（x±s）］

3　討論

目前認(rèn)為MSC主要通過分泌相關(guān)細(xì)胞因子在修復(fù)受損心肌中發(fā)揮旁分泌作用。MSC能夠分泌多種細(xì)胞因子，包括炎癥、造血、神經(jīng)發(fā)育和血管再生等相關(guān)的細(xì)胞因子。MSC可分泌IL-6、IL-12、粒細(xì)胞集落刺激因子和干細(xì)胞因子［1，2］。MSC還能夠分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管內(nèi)皮生長因子［3］，分泌膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子。而缺氧預(yù)處理可提高MSC的生存能力，缺氧損傷能夠激活多種細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和間質(zhì)源因子（SDF-1）等的分泌［4］。大量實驗證實體外缺氧缺血預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能更有效改善心功能。機制可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血環(huán)境下通過分泌一些細(xì)胞發(fā)揮重要作用。本實驗將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)的體系中，分析其分泌的細(xì)胞因子變化，結(jié)果顯示：上清液中 ICAM-1、IFN-γ以及IL-10的濃度明顯降低。

ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成員，ICAM-1 在靜息的血管內(nèi)皮細(xì)胞上呈低水平表達(dá)，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)活性［5、6］。IFN-γ可增強自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。IL-10是由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生和具有多向性生物活性的強的免疫抑制因子，改變機體的免疫應(yīng)答和MHCⅡ類抗原的表達(dá)，并介導(dǎo)Th1和Th2兩類T細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)。IL-10抑制Th1介導(dǎo)的DTH反應(yīng)，對臨床的器官移植、抗炎癥、抗寄生蟲病和某些傳染病的治療將有潛在應(yīng)用前景。

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Objective To study the secreted cytokine concentration changes of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in ischemic conditions. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured by adherent culture of whole bone marrow.The third generation of cells were used in this study. The experiments were divided into two groups：A. The supernatant wwas collected from normal cell culture. B. The supernatant was from cells in serum-free medium 24h. 27 kinds of cytokines in the supernatant were analyzed through the protein assay. Results Compared with the normal culture condition group，the concentration of ICAM-1，IFN- γ and IL-10 in the serum-free culture group were signifi cant decreased.（P＜0.05）. Conclusion There were changes in the infl ammation related cytokines secreted by bone marrow mesenchymal stem cells in the ischemic condition.

Bone marrow mesenchymal stem cells Ischemic conditions cytokines

蘇州市科技計劃項目資助（SYS201327）

215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院