王艷玲，劉光萬(wàn)，吳麗娟，曲洪媛，趙芳，楊光，吳昌琳△

(1.華東師范大學(xué)物理系，上海磁共振重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062； 2.蘇州博創(chuàng)同康生物工程有限公司，蘇州 215347)

1 引 言

出血是戰(zhàn)傷、外科手術(shù)和日常意外事故中常常遇到的問(wèn)題，甚至危及人們的生命，因此，研究新型的快速、有效的止血材料一直是人們關(guān)注的話(huà)題[1-2]。對(duì)于血流量豐富、脆性大的實(shí)質(zhì)性臟器如腦、肝臟、腎臟和脾臟等創(chuàng)面進(jìn)行機(jī)械性止血易造成其組織損傷、針眼出血或裂口出血，嚴(yán)重的甚至影響器官的功能。

對(duì)此，國(guó)內(nèi)外一直致力于研制對(duì)實(shí)質(zhì)臟器創(chuàng)面迅速止血并且對(duì)其功能影響小、生物相容性好的止血材料。目前以分子篩吸水機(jī)理止血的血液因子濃縮類(lèi)止血產(chǎn)品在臨床上和軍事上發(fā)揮重要的作用。如美國(guó)Z-Medica公司生產(chǎn)的QuikClot沸石基止血粉通過(guò)FDA的批準(zhǔn)用于嚴(yán)重出血?jiǎng)?chuàng)傷的急救，然而其在使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生超過(guò)100℃的高溫，造成創(chuàng)面組織的損傷[3～5]。美國(guó)Medafor公司生產(chǎn)的“Arista”可吸收性淀粉止血微球，雖然具有很好的安全性及良好的止血效果，但價(jià)格昂貴并且作為體內(nèi)止血材料，其粘附性、吸液性不夠強(qiáng)，特別是表氯醇交聯(lián)劑可能存在潛在的毒性[6]，因此，針對(duì)以上血液因子濃縮類(lèi)止血材料存在的不足，本研究介紹一種新型淀粉基止血材料的制備及其性能研究。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

馬鈴薯淀粉，氫氧化鈉，鹽酸均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；透明質(zhì)酸由華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司提供(山東)；三偏磷酸鈉由亞科化學(xué)試劑有限公司提供(蘇州)；Arista微球購(gòu)自美國(guó)Medfor公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌機(jī)，上海汗諾儀器有限公司；HH-5恒溫水浴鍋，金壇市瑞華儀器有限公司；DJ-V60A型電子天平，蘇州江東精密儀器；PH168A酸度計(jì)，蘇州英格泰電子科技有限公司；TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；VFD2000G真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Hitachi S-4800型電子掃描顯微鏡(日立)；Ultima IV X-射線(xiàn)粉末衍射儀，日本理學(xué)；DSC-6100差示掃描量熱儀，Seiko Instruments。

2.3 新型淀粉基止血粉

2.3.1制備方法 (1)可溶性淀粉的糊化：稱(chēng)取一定量的淀粉并加入到蒸餾水中，加熱攪拌得到均勻透明的淀粉溶液，靜置待用。(2)交聯(lián)反應(yīng)：按照一定的比例將透明質(zhì)酸和三偏磷酸鈉加入到上述的淀粉溶液中。并加入氫氧化鈉，使溶液的pH維持在堿性環(huán)境。恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)充分。(3)制備顆粒：加入鹽酸中和。取乳白色液體用蒸餾水反復(fù)洗滌數(shù)次，將所得沉淀物冷凍干燥。凍干的樣品粉碎成顆粒，保存待用。

2.3.2結(jié)構(gòu)表征 (1)結(jié)構(gòu)觀(guān)察：用肉眼觀(guān)察新型淀粉基止血顆粒的顏色及宏觀(guān)結(jié)構(gòu)狀態(tài)；用電子掃描顯微鏡(SEM)觀(guān)察顆粒的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。(2)結(jié)構(gòu)分析：材料反應(yīng)前后的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定用X-射線(xiàn)粉末衍射儀(XRD)，CuKα，40 kV×40 mA，掃描速度6°/min。

2.4 熱穩(wěn)定性

用差示掃描量熱儀對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行熱穩(wěn)定分析。加熱速率為10℃/min。

2.5 生物相容性研究

2.5.1皮膚刺激試驗(yàn)和致敏試驗(yàn) 根據(jù)刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)[7]，每只新西蘭家兔分別有兩個(gè)試驗(yàn)材料區(qū)域和兩個(gè)對(duì)照材料區(qū)域，分別將一定量的新型淀粉基樣品及對(duì)照組樣品(Arista止血微球)浸提液注射于設(shè)置好的皮膚區(qū)域，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀(guān)察皮膚的紅斑和紅腫反應(yīng)狀況(每種樣品分別用3只家兔)；致敏試驗(yàn)采用小白鼠，隨機(jī)分為3組，每組3只。A組注射新型淀粉基止血材料浸提液，B組注射同等劑量的Arista止血微球浸提液，C組注射同等劑量的生理鹽水，隨后觀(guān)察包塊全身的反應(yīng)及包塊吸收所用時(shí)間。

2.5.2全身急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)采用昆明種小鼠12只，體重18～22 g。隨機(jī)分為2組，進(jìn)食不禁水。試驗(yàn)組注射新型淀粉基止血顆粒的浸提液，對(duì)照組注射生理鹽水。注射24、48和72 h后觀(guān)察小鼠的體重、飲食、呼吸、運(yùn)動(dòng)、排便和皮膚黏膜等的變化。

2.5.3細(xì)胞毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)采用L929成纖維細(xì)胞，細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照國(guó)標(biāo)GB/T 16886.5 MTT比色法進(jìn)行。將制備好的細(xì)胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃)培養(yǎng)24 h后除去上清液。陽(yáng)性對(duì)照組加入陽(yáng)性對(duì)照浸提液，陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照浸提液，空白對(duì)照組加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，樣品組加入新型淀粉基止血粉浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率同時(shí)評(píng)定細(xì)胞毒性[8]。

3 結(jié)果

3.1 掃描電鏡觀(guān)察

從電鏡照片可以看出，交聯(lián)前樣品(原淀粉)表面布滿(mǎn)裂紋，但是幾乎看不出有孔洞；而經(jīng)過(guò)三偏磷酸鈉交聯(lián)工藝后，樣品(磷酸化的淀粉-透明質(zhì)酸)表面及其內(nèi)部具有許多相連的孔，呈現(xiàn)出三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)大大增加了止血顆粒的比表面積，并有助于吸收血液的液體成分，阻止血液的固形成分形成凝膠，從而促進(jìn)止血。

圖1 掃描電鏡圖片

3.2 X-射線(xiàn)衍射光譜分析

見(jiàn)圖2。

圖2 兩種樣品的X射線(xiàn)衍射圖片F(xiàn)ig 1 XRD image of two samples

從圖2中可以看出，原淀粉在2θ為18°處有強(qiáng)結(jié)晶峰，2θ在23°處有兩個(gè)微弱的結(jié)晶峰；但隨著交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，2θ為18°的強(qiáng)結(jié)晶峰逐漸減弱，并且在23°處的兩個(gè)弱結(jié)晶峰逐漸合并為一個(gè)。這表明原淀粉在交聯(lián)的過(guò)程中，結(jié)晶性遭到一定程度的破壞，形成了更多的無(wú)定形區(qū)域。

3.3 熱穩(wěn)定性分析

由于結(jié)合水蒸發(fā)時(shí)所顯示的吸熱峰可以反映樣品交聯(lián)反應(yīng)前后分子的變化，見(jiàn)圖3。新型交聯(lián)淀粉基樣品在100℃左右的吸熱峰面積明顯大于原淀粉的吸熱峰面積，表明該交聯(lián)淀粉基樣品中含有更高的結(jié)合水含量，由于少量透明質(zhì)酸的加入可能有助于樣品保持更多的水分[9]。另外，值得一提的是新型交聯(lián)淀粉基樣品的吸熱峰溫度區(qū)域較原淀粉大，這可以解釋為交聯(lián)反應(yīng)在一定程度上提高了新型淀粉基樣品的熱穩(wěn)定性。

3.4 生物相容性分析

3.4.1皮膚刺激試驗(yàn) 在新西蘭家兔脊柱兩側(cè)的實(shí)驗(yàn)區(qū)域分別注射新型淀粉基樣品和對(duì)照組樣品的浸提液，并在24、48和72 h觀(guān)察試驗(yàn)區(qū)域的皮膚反應(yīng)情況。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.10對(duì)皮膚反應(yīng)程度的等級(jí)記分系統(tǒng)，新型淀粉基樣品一側(cè)和對(duì)照組樣品試驗(yàn)側(cè)皮膚均沒(méi)有出現(xiàn)水腫、紅斑等，并且新型淀粉基樣品組和對(duì)照組的皮膚反應(yīng)為0分。由此說(shuō)明所制備樣品沒(méi)有皮內(nèi)反應(yīng)。

圖3 兩個(gè)樣品的DSC曲線(xiàn)Fig 3 DSC curves of two sample

3.4.2致敏試驗(yàn) 新型淀粉基樣品組與Arista微球組致敏試驗(yàn)表明試驗(yàn)小白鼠的精神正常，呼吸和運(yùn)動(dòng)也均正常，并且試驗(yàn)周?chē)つw未見(jiàn)明顯的水腫和紅斑等致敏作用；但是陽(yáng)性對(duì)照組的注射區(qū)域和周?chē)つw均可見(jiàn)紅斑。

3.4.3全身急性毒性試驗(yàn) 在注射樣品浸提液和生理鹽水后，新型淀粉基樣品組、Arista微球組和生理鹽水組的小白鼠在連續(xù)觀(guān)察期間活動(dòng)、臨床表現(xiàn)正常，體重增幅也基本無(wú)差異，表明本研究所制備的新型淀粉基樣品無(wú)全身急性毒性反應(yīng)。

3.4.4細(xì)胞毒性試驗(yàn) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5中規(guī)定的細(xì)胞毒性0 ～ 1級(jí)分級(jí)原則，陽(yáng)性對(duì)照組為2級(jí)，陰性對(duì)照組為0級(jí)。本研究所制備的新型淀粉基止血材料的細(xì)胞毒性反應(yīng)小于1級(jí)，因此符合臨床使用要求。有文章表明一定量的透明質(zhì)酸具有選擇性調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞黏附和增殖的功能[10]，這也是該新型淀粉基止血材料優(yōu)于其他止血材料的功能。

4 討論

本研究以馬鈴薯淀粉為主要原料，加入少量透明質(zhì)酸并通過(guò)三偏磷酸鈉的交聯(lián)工藝制備出的可完全降解吸收的多糖顆粒具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該顆?？裳杆傥昭褐械乃?，同時(shí)有效阻止血液中的固形成分(如止血因子、紅細(xì)胞、血小板和纖維蛋白原等)形成凝膠；另外固形成分的凝聚加快了內(nèi)源性凝血機(jī)制的啟動(dòng)，因此，該新型淀粉基止血材料具有非常好的止血功能。另外通過(guò)DSC熱穩(wěn)定性分析可知，新型淀粉基止血材料較原淀粉具有良好的熱穩(wěn)定性，有利于材料的加工，存儲(chǔ)及使用。

止血材料必須經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有良好生物相容性才能應(yīng)用于臨床。本研究按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)系列展開(kāi)了較全面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：無(wú)皮內(nèi)和致敏反應(yīng)、無(wú)全身急性毒性反應(yīng)、無(wú)細(xì)胞毒性，證明該新型淀粉基止血材料具有良好的生物相容性。

因此，此新型淀粉基止血材料是一種較為理想的止血材料，改進(jìn)了現(xiàn)有止血材料的弊端，有望應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。