宋 洋，王 靜，陳曉明*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；2.天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300384）

表面等離子共振傳感器檢測3 種果汁中亞胺硫磷殘留

宋 洋1，王 靜1，陳曉明2，*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；2.天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300384）

基于亞胺硫磷多克隆抗體，建立蘋果汁、桃汁、橙汁中亞胺硫磷殘留的表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器檢測方法。采用磷酸鹽緩沖液直接稀釋樣品10倍后，基本消除基質(zhì)影響，加標回收率為84.88%～104.69%，變異系數(shù)低于6.70%，樣品的最低檢出限為0.1 μg/L，與高效液相色譜檢測結果相關系數(shù)為0.992，所建立的SPR檢測方法達到了快速準確檢測的要求。SPR反應芯片對亞胺硫磷的檢測時間為30 min，且在3 d內(nèi)可反復檢測30 次，可有效降低檢測成本。通過與同源抗體建立的酶聯(lián)免疫方法比較發(fā)現(xiàn)：SPR方法在檢測限、精確度、靈敏度等方面有著一定優(yōu)勢，但對于單殘留樣品的檢測，在時間上不具有明顯優(yōu)勢，更適合于高通量、多殘留的檢測。

果汁；亞胺硫磷；表面等離子共振傳感器；酶聯(lián)免疫

果汁飲品在日常生活中被普遍接受，但是在種植過程中，為了保證水果品質(zhì)及產(chǎn)量，各類農(nóng)藥被廣泛使用，因此果汁也就無可避免地含有農(nóng)藥殘留。2012年，可口可樂公司果粒橙被檢出農(nóng)藥超標，果汁的農(nóng)藥殘留問題受到廣泛關注。由于不同國家的經(jīng)濟和科技發(fā)展水平都存在著較大差距，導致在發(fā)達國家已經(jīng)遭到禁用的高毒性、高殘留農(nóng)藥，在某些發(fā)展中國家可能仍在使用，造成了各國在食品安全標準上存在差距［1］。目前國內(nèi)外還沒有針對果汁中亞胺硫磷的限量標準，只以相應水果的最高殘留限量標準（maximum residue limit，MRL）作為參考，日本肯定列表對食品中亞胺硫磷殘留限量標準中規(guī)定：蘋果、桃、橙子、杏的最大殘留限量分別為10、10、10、5 mg/kg。因此，能夠準確可靠地測定果汁中農(nóng)藥殘留物的科學分析就顯得非常重要。亞胺硫磷是中等毒性的有機磷農(nóng)藥，廣泛應用在水果、蔬菜和糧食作物的生產(chǎn)中［2-3］。美國環(huán)?？偸饘啺妨蛄自? 種作物上的使用（杏樹、蘋果、越橘、葡萄、海棠、李子、油桃、梨、桃）做出了限定使用次數(shù)的決定，并增加了在大部分作物上的限制使用時間間隔，要求附加工人生物監(jiān)控數(shù)據(jù)和使用限制［4-6］。目前亞胺硫磷主要的檢測手段是利用大型儀器設備，如氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）已建立了多種蘋果［7］、西瓜［8］、蔬菜［9］、茶葉［10-11］及糧油［12］的儀器檢測方法，其方法準確、靈敏，但儀器方法資本投入大，檢測時間較長，因此不能完全滿足目前食品安全檢測的需要。21世紀初，酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法作為靈敏、高效、快速的檢測技術得到飛速發(fā)展。Liang Ying等［13-14］利用亞胺硫磷硫代磷酸酯半族進行結構衍生，制備出硫代磷酸酯有機磷農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，IC50達到159.7 ng/mL；Song Yang等［15］利用對亞胺硫磷結構鄰苯二甲酰亞胺半族結構進行衍生，合成人工抗原，成功制備出多克隆抗體，IC50達到2 0.0 n g/m L，對蘋果、桃、黃瓜、甘藍等進行了檢測，達到了滿意的效果。

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是基于免疫學原理，兼有儀器方法和免疫學方法的優(yōu)勢［16］。在21世紀初，已有國外學者成功地利用SPR技術對環(huán)境水中的農(nóng)藥殘留進行了檢測［17-19］。Dong Jianwei等［20］利用分子印跡聚合物作為識別元件偶聯(lián)在SPR芯片表面，對環(huán)境水中丙溴磷的半定量檢測。結果表明，高靈敏的識別元件可以有效提高檢測的準確度和穩(wěn)定性。Liu Ming等［21］建立了豬肉中萊克多巴胺高靈敏度SPR間接檢測方法，并對全抗原芯片敏感膜的穩(wěn)定性、準確性、反應離子體系等進行了詳盡的研究。目前，利用SPR技術檢測食品中小分子農(nóng)藥的殘留，其間接競爭法因穩(wěn)定性及靈敏度較好，在SPR檢測中使用最為多見，如2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）［22-23］、葉酸［24］等。Song Yang等［25］建立了蔬菜食品中亞胺硫磷的SPR檢測方法，其檢測限達到了ppt級的痕量檢測。

本實驗基于多克隆抗體研究，在修飾的金片表面結合了抗原，對3 種果汁樣品中亞胺硫磷殘留進行快速檢測，經(jīng)HPLC進行方法驗證。該方法具有不需標記、自動化程度高、高效等優(yōu)勢，且偶聯(lián)的芯片可反復使用多次，大大降低了成本，且偶聯(lián)好的芯片可攜帶至檢測機構，更加提高了現(xiàn)場檢測的效率。本實驗對樣品檢測的時間、芯片的穩(wěn)定性及檢測限等方面與同源抗體建立的ELISA方法進行了評價和比對，為果汁樣品的快速檢測提供了理論依托和技術保障。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

100%蘋果汁、100%桃汁、100%橙汁（經(jīng)HPLC檢測，均不含有亞胺硫磷） 市購。

亞胺硫磷（99%）、Tween-20、乙醇胺、碳二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide h y d r o c h l o r i d e，E D C）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide， 1-hydroxypyrrolidine-2，5-dione，NHS）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）（99%） 美國Sigma公司；巰基十一酸 百靈威科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2儀器與設備

ESPRIT表面等離子共振生物傳感器、芯片 荷蘭Auto Lab公司；LC-10AT高效液相色譜 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1常用緩沖溶液

0.01mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）；10mmol/LpH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液；PBST緩沖液；100mmol/L NHS溶液；400 mmol/L EDC溶液；1 mmol/L巰基十一酸溶液；1mol/L乙醇胺（pH 8.5）。

1.3.2多克隆抗體

亞胺硫磷多克隆抗體建立在對其結構的衍生化，得到的半抗原（hapten-PH），經(jīng)過與鑰孔血藍蛋白偶聯(lián)得到的免疫原，對新西蘭大白兔進行免疫得到多克隆抗體anti-PH。經(jīng)Protein A-Sepharose 4B純化得到的抗體質(zhì)量濃度為3.50 mg/mL。建立的亞胺硫磷直接競爭ELISA方法靈敏度為20.00μg/L，檢測限為0.60μg/L［15］。

1.3.3SPR亞胺硫磷標準曲線的建立

以無待測小分子抑制的響應值為B0值，一定質(zhì)量濃度的待測小分子抑制時的響應值為B值，可按式（1）計算抑制率：

以小分子質(zhì)量濃度的負對數(shù)為橫坐標，以B/B0為縱坐標，繪制標準曲線，獲得回歸方程。每個質(zhì)量濃度測得3 個重復值，對其響應值（y）進行測定，見式（2）。

式中：x為亞胺硫磷的質(zhì)量濃度/（ng/L）；A為空白溶液的響應值，即不加亞胺硫磷競爭抗原的響應值；D為亞胺硫磷質(zhì)量濃度趨于無窮大時所對應的響應值，可用溶液的背景值代替。

1.3.4樣品前處理

SPR：取1 mL果汁于管中，加入的亞胺硫磷標準品后的質(zhì)量濃度水平為0.1、0.2、0.5 μg/L，樣品經(jīng)PBS稀釋10 倍后，過0.22 μm濾膜，待用。

ELISA：取1 mL果汁于管中，加入的亞胺硫磷標準品后的質(zhì)量濃度水平為30、100、200 μg/L，樣品經(jīng)PBS稀釋20 倍，待用。

HPLC：取樣前先將果汁搖勻，在分液漏斗中倒入量取100 mL果汁，并依次加入50 mL乙腈、5 g氯化鈉，用力搖動分液漏斗5 min，待氯化鈉溶解完全后，將漏斗靜置10 min；棄去水層后再反復萃取3 次，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至小體積，后用氮氣吹至盡干，用1 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，供HPLC分析。

1.3.5色譜條件

采用LC-10AT HPLC儀，確定亞胺硫磷的HPLC檢測條件為：檢測器：Waters 2998PDA；檢測波長：218 nm；色譜柱：C18（15 cm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動相：乙腈-水 （45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：35 ℃。

1.3.6SPR芯片穩(wěn)定性研究

對同一芯片與抗體多次反應，考察其響應值變化，判斷固定化后的芯片使用上限；對芯片進行PBS封閉保存，分別在1、2、3 d對其與抗體反應的響應值進行比較，通過變異系數(shù)的考量，判斷其保存時間。

2　結果與分析

2.1亞胺硫磷SPR標準曲線的構建

圖1　亞胺硫磷SPR標準曲線Fig.1 SPR standard curve of phosmet

在巰基十一酸溶液自組裝芯片上偶聯(lián)20 mg/L PHBSA，將16 mg/L的抗體anti-PH與將不同質(zhì)量濃度的亞胺硫磷標準溶液等體積混合，使得亞胺硫磷標準溶液質(zhì)量濃度分別為（0.0、0.5、2.0、8.0、16.0、32.0、64.0、256.0 n g/L），反應緩沖液為1 0 m m o l/L pH 7.4 PBS，工作溫度25 ℃，再生液 0.1 mol/L HCl溶液，抗體反應時間30 min。如圖1所示，建立的SPR亞胺硫磷標準曲線，其最低檢出限為1.6 ng/L，IC50為10.0 ng/L，線性范圍為8.0～60.0 ng/L（RSN= 3）［25］。

2.2果汁基質(zhì)影響的消除

消除基質(zhì)影響是為了最大化地降低樣品中影響抗原抗體結合的影響因子的作用，使樣品的基質(zhì)曲線與標準曲線基本重合。果汁中的糖和色素是基質(zhì)影響的主要因子，通常通過SPE小柱進行凈化后去除。SPR建立在免疫學基礎上，結合光學測定原理，可對渾濁或不透明的樣品進行測定，因此可省去復雜的前處理。由圖2可以看出，果汁通過PBS緩沖液稀釋10 倍后，其SPR基質(zhì)曲線與標準曲線基本重合；通過PBS稀釋20 倍后，其ELISA基質(zhì)曲線與標準曲線基本重合，說明基質(zhì)的影響基本消除，可以進行添加回收實驗。

圖2　亞胺硫磷樣品的SPR（A）及ELISA（B）基質(zhì)曲線Fig.2 SPR and ELISA standard curves of phosmet in juice samples

2.3SPR方法準確度評價

表1表明，SPR方法回收率為84.88%～104.69%，變異系數(shù)低于6.7 0%；E L I S A方法回收率為79.17%～104.98%，變異系數(shù)低于8.02%。與HPLC方法的線性相關系數(shù)R2值分別為0.992和0.985，均滿足準確度要求。

表1　SPR、ELISA添加回收結果與HPLC相關系數(shù)（n=4）Table 1 Recoveries of phosmet in spiked juices by SPR and ELISA and linear correlations of the two methods with HPLC （n= 4）

2.4芯片的穩(wěn)定性評價

自組裝芯片表面的裸金層和在巰基修飾后是很穩(wěn)定的，一般在極端pH值和中等質(zhì)量濃度的有機試劑條件下具有較強耐受，可在4 ℃的實驗條件下放置3 個月，穩(wěn)定性較好。當配體被固定于傳感芯片表面上，傳感器芯片對于各種試劑和條件的耐受程度就主要取決于所連配體的性質(zhì)，如配體濃度、抗酸堿度、結構穩(wěn)定性等，因此不同反應芯片的穩(wěn)定性各不相同。

圖3　芯片的使用次數(shù)與響應值關系Fig.3 Relationship between repeated chip use and response value

考察一個固定化后的反應芯片在與抗體反應多次后，響應值的變化情況。同一反應芯片在1、2、3 d時，與抗體反應的響應值分別為68.50、157.62、142.33 m°，結合圖3可以看出，反應芯片與抗體反應30 次，響應值均比較穩(wěn)定，無明顯變化，而之后再次反應，即出現(xiàn)下降趨勢，表示亞胺硫磷反應芯片的使用上限為30 次。反應芯片在PBS封閉條件下保存3 d，將1、2、3 d的響應值比較，得到3 d的響應值變異系數(shù)為8.4%，說明芯片在液體封閉條件下可保存3 d。為了節(jié)省實驗成本，實驗中共反復使用1、2、3 g 3 個芯片進行測定，抗體反應的響應值分別為168.50、154.6、148.7 m°，不同芯片與抗體響應值變異系數(shù)為6.46%，表明偶聯(lián)全抗原芯片的穩(wěn)定性較好，該檢測芯片具有應用和推廣意義。

2.5SPR樣品檢測時間評價

16 μg/mL的抗體anti-PH與芯片上的完全抗原結合，對亞胺硫磷進行SPR檢測。將抗原抗體反應時間分別設定為10、20、30 min進行檢測，其他工作條件保持不變，對建立的標準曲線進行分析，比較各檢測質(zhì)量濃度的變異系數(shù)。由表2可知，反應時間在30 min時，各質(zhì)量濃度的變異系數(shù)較低，有穩(wěn)定的響應信號，表明重現(xiàn)性較好，當反應時間不充分時，各質(zhì)量濃度值具有較大的偏差。因此亞胺硫磷SPR檢測時間設定為30 min。

表2　抗體在芯片表面反應不同時間對應的相對響應值及標準差（n= 7）Table 2 Relative response values with standard deviations for the antibody on the chip surface at different reaction times （n= 7）

2.6SPR與ELISA對果汁檢測方法比較

表3　SPR與ELISA檢測果汁方法對比Table 3 Comparison of SPR biosensor and ELISA used for phosmet detection in juices

對3 種果汁中亞胺硫磷殘留進行了SPR樣品檢測，并在樣品前處理方法、添加回收實驗、與HPLC對照實驗相關系數(shù)、檢測時間、抗體質(zhì)量濃度等方面進行了系統(tǒng)比較。如表3所示，SPR和ELISA在樣品前處理方面較儀器方法有著明顯優(yōu)勢，且SPR在靈敏度和準確度均高于ELISA方法。SPR檢測時間為30 min，并且同一固定化芯片可在3 d內(nèi)重復檢測30 次，大大節(jié)省了檢測成本。ELISA方法能2～3 h檢測幾十個樣品，由此可見SPR在單殘留的檢測中，其優(yōu)勢并不明顯。為了更好地發(fā)揮SPR高質(zhì)量、高通量快速現(xiàn)場檢測的優(yōu)勢，今后應大力發(fā)展SPR在多殘留檢測中的應用。

3　結 論

SPR技術是近些年來在食品安全快速檢測領域的發(fā)展的新技術，因其靈敏度高、前處理方法簡單、自動化程度高、省時等特點，適合于大批量樣品的現(xiàn)場檢測。本實驗在多克隆抗體的基礎上，建立了果汁中亞胺硫磷SPR檢測方法，樣品最低檢出限為0.1 μg/L，遠低于國際限量標準，添加回收率在84.88%～104.69%，與HPLC方法的線性相關系數(shù)R2為0.992，為果汁中亞胺硫磷農(nóng)藥殘留的快速檢測提供了新的技術支持。

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Surface Plasmon Resonance Detection of Phosmet Residues in Three Kinds of Juice

SONG Yang1， WANG Jing1， CHEN Xiaoming2，*
（1. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， College of Life Science， Tianjin Normal University，Tianjin 300387， China； 2. Tianjin Institute of Forestry and Fruit Tree， Tianjin 300384， China）

In the present study， a polyclonal antibody-based method for the quantifi cation of phosmet residues in apple，peach and orange juice was presented using a surface plasmon resonance （SPR） sensor. Samples were directly diluted with PBS to eliminate the matrix effect. Good accuracy and precision were obtained with mean spiked recoveries between 84.88% and 104.69% and coeffi cients of variation less than 6.70%， and the limit of detection （LOD） of juice samples was 0.1 μg/L. The SPR method allowed rapid and accurate detection of phosmet and the correlation coeffi cient （R2） between the data obtained using the method and high-performance liquid chromatography （HPLC） was 0.992. The chip used in the SPR method detected phosmet in 30 min， and could be repeatedly used 30 times within 3 days， reducing the cost of tests. The SPR method was advantageous in the terms of detection limit， accuracy and sensitivity rather other time saving in single-residue analysis compared with the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and was more suitable for highthroughput detection of multi-residues.

juice； phosmet； surface plasmon resonance （SPR） sensor； enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）

R155

A

1002-6630（2015）18-0172-05

10.7506/spkx1002-6630-201518031

2014-12-25

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301487）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B03）；天津市自然科學基金項目（13JCQNJC14800）

宋洋（1983—），女，博士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：skysongy@mail.tjnu.edu.cn

陳曉明（1977—），男，助理研究員，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與開發(fā)。E-mail：chxm001@126.com