張曉麗，毛立新，范三紅*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

同步熒光法結(jié)合主成分分析法鑒別橙汁品質(zhì)

張曉麗，毛立新，范三紅*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

對(duì)鮮榨橙汁與市售某品牌橙汁進(jìn)行同步熒光掃描得到其三維熒光光譜，并從光譜中提取出3 組特征峰。然后結(jié)合其中熒光物質(zhì)的特性，得知這3 組特征峰對(duì)應(yīng)物質(zhì)分別為VB2、VB6和黃酮類物質(zhì)。同時(shí)，采用主成分分析法結(jié)合于激發(fā)波長240～640 nm、發(fā)射波長與激發(fā)波長差為30 nm條件下掃描而得的同步熒光光譜數(shù)據(jù)對(duì)所有橙汁樣品進(jìn)行聚類并識(shí)別，效果良好。結(jié)果表明：將熒光光譜技術(shù)與光譜模式識(shí)別方法相結(jié)合，可為橙汁品質(zhì)鑒別提供有力技術(shù)支持。

橙汁；同步熒光法；主成分分析

隨著社會(huì)生活及人們營養(yǎng)認(rèn)知水平的提高。消費(fèi)者逐漸傾向于飲用鮮榨果汁或者原果汁。橙汁即為原果汁添加量100%不含添加劑的飲品，由于其營養(yǎng)豐富口味大眾已成為果汁銷量中最大的一類。因此不法商販為牟取暴利有意偷工減料、摻偽摻雜，不僅侵害消費(fèi)者權(quán)益且有損行業(yè)形象。鑒于此，食品工作者應(yīng)積極尋找鑒別此類摻假的有效分析方法。使橙汁產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。橙汁制偽一般為以糖、酸、香精、色素、水加以調(diào)配成完全不含原果汁的“三精水”，或是在稀釋果汁中摻入糖、有機(jī)酸冒充原果汁或鮮榨橙汁［1-2］。

現(xiàn)有橙汁鑒偽分析檢測(cè)方法主要是感官評(píng)定法，此法最簡(jiǎn)單，但過度依賴評(píng)定人員的經(jīng)驗(yàn)且主觀性強(qiáng)；其次是標(biāo)樣比較法，國外有荷蘭食品研究檢察所31 項(xiàng)果汁分析內(nèi)容及德國水果原汁基因重組鏈激酶值檢測(cè)方法，此二者客觀準(zhǔn)確但所需檢測(cè)項(xiàng)目過多，實(shí)際應(yīng)用中較難推廣。我國GB/T 16771—1997《橙、柑、橘汁及其飲料中果汁含量的測(cè)定》只有6 項(xiàng)指標(biāo)，與彼相比又失之簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性降低。且有研究指出，此6 項(xiàng)指標(biāo)與橙汁含量相關(guān)性均未達(dá)到顯著相關(guān)水平。在上有基礎(chǔ)上又發(fā)展出“主要成分檢測(cè)法”，以原橙汁中主要成分作為原汁含量依據(jù)結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)進(jìn)行判別。如采用毛細(xì)管等速電泳及真空紫外檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)柑橘汁樣品中的陰離子，獲得特征區(qū)帶與標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照，判斷是否摻假。利用呈香物質(zhì)中各自特征成分不同的特點(diǎn)利用新型的傳感器陣列技術(shù)，分析柑橘汁49 個(gè)樣品的香氣成分，建立數(shù)據(jù)庫用于柑橘汁分類。結(jié)合高效液相色譜和氣相色譜技術(shù)，可用于檢測(cè)摻假情況。熒光檢測(cè)法正是以此為原理，借助樣品中熒光物質(zhì)表現(xiàn)出的性質(zhì)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法及計(jì)算機(jī)軟件對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行鑒偽。上述方法有些比同步熒光法準(zhǔn)確但是操作繁瑣成本高，有些比同步熒光法簡(jiǎn)便，但是覆蓋信息可能不太全面。同步熒光法與其相比，快速、安全、無損且是針對(duì)樣品整體進(jìn)行操作，可反映樣品中所有熒光物質(zhì)的信息［2-8］。

同步熒光法即同時(shí)對(duì)激發(fā)和發(fā)射2 個(gè)單色器波長進(jìn)行掃描，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)的波長得到同步熒光光譜圖，本實(shí)驗(yàn)采用同步熒光法中的恒波長同步熒光法。與常規(guī)熒光法相比，同步熒光分析法具有簡(jiǎn)化譜圖、提高選擇性、減少散射干擾等特點(diǎn)，尤其適合多組分混合物的分析測(cè)定。而且結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)其數(shù)據(jù)加以解釋彌補(bǔ)其相對(duì)于色譜法選擇性差的缺點(diǎn)。而且同步熒光法現(xiàn)已用在諸多食品的不同方面監(jiān)測(cè)如：對(duì)五糧液、茅臺(tái)醇和高溝進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)，可準(zhǔn)確將五糧液與其他白酒區(qū)分開來；建立了紅河州不同地區(qū)野山茶的熒光指紋圖譜；對(duì)食用調(diào)和油中摻入不同比例地溝油的樣品分析其三維熒光光譜圖中VE產(chǎn)生的熒光峰的特征可作為調(diào)和油中是否摻入地溝油的判據(jù)等［9-20］。

PCA是指把原有數(shù)據(jù)中較多的指標(biāo)簡(jiǎn)化為少數(shù)幾個(gè)既不相關(guān)又能綜合反映原來多指標(biāo)所提供信息主要部分的新的綜合指標(biāo)。這些新的綜合指標(biāo)稱為原來指標(biāo)的主成分，并且按照其所含原數(shù)據(jù)信息的大小依次稱為第1主成分、第2主成分。從而利用這些主成分對(duì)原有數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀表達(dá)或者進(jìn)行分類、回歸等分析：如梁曼等［20］利用PCA分析經(jīng)預(yù)處理后的不同品種藻類的光譜數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示幾種藻類樣品在主成分特征空間中獨(dú)立分布，所以可借此對(duì)藻類進(jìn)行鑒別；王春艷等［18］利用PCA對(duì)2 套不同層次原油相關(guān)樣品進(jìn)行分類識(shí)別，結(jié)果在載荷圖中可得出不同相關(guān)樣品在油源上的相似程度，可實(shí)現(xiàn)溢油樣品準(zhǔn)確識(shí)別；國外學(xué)者利用PCA結(jié)合淺表面熒光法以肌肉中固有熒光物質(zhì)表現(xiàn)出的光譜特征可快速鑒別魚的新鮮程度［19-22］。

因此，先前學(xué)者有利用同步熒光法所得圖譜特征對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行鑒別分析，也有學(xué)者利用PCA結(jié)合其他熒光光譜法對(duì)多種樣品進(jìn)行判別鑒定分析。此次利用PCA結(jié)合同步熒光法對(duì)橙汁品質(zhì)進(jìn)行鑒別，為橙汁鑒偽提供又一行之有效的簡(jiǎn)便方法，且增加了同步熒光法的用途。

此次工作對(duì)6 種不同原料所榨橙汁和市售某品牌橙汁進(jìn)行同步熒光光譜掃描，并通過繪圖軟件合成同步熒光指紋圖譜和二維圖譜，通過分析圖譜及其提供的特征參數(shù)并結(jié)合PCA實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同來源橙汁的快速鑒別。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

贛南橙、臍橙、丑柑、金橘、蜜橙、蘆柑和某品牌橙汁都購買于太原市沃爾瑪超市。前6 種橙果都凍藏于冰箱中，某品牌橙汁避光貯藏于0～4 ℃的冰箱中，測(cè)定時(shí)提前取出待橙果解凍后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2儀器與設(shè)備

RF-530熒光檢測(cè)計(jì) 日本島津公司；N3000色譜工作站 浙江大學(xué)智能信息研究所；AeTGL-16G臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3方法

1.3.1樣品制備

橙果用流動(dòng)冷水解凍，去皮去籽然后以榨汁機(jī)處理再用4 層紗布過濾，濾液離心處理取上清液進(jìn)行梯度稀釋。離心條件：3 000 r/min，15min。

橙汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大、顏色偏深，為避免熒光檢測(cè)中出現(xiàn)熒光淬滅及拉曼散射等現(xiàn)象。采用稀釋的梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)橙汁進(jìn)行同步熒光掃描，以期獲得峰形良好、熒光強(qiáng)度適當(dāng)?shù)南♂屬|(zhì)量分?jǐn)?shù)及掃描波長差。最終采用5%的稀釋液。

PCA中贛南橙、臍橙、蜜橙都取4 個(gè)批次，分別編號(hào)為G1～G4、Q1～Q4、M1～M4，丑柑取3 個(gè)批次，金橘一個(gè)批次，編號(hào)如上。

1.3.2同步熒光光譜采集

燈源：75 W氙燈；單色器：閃耀式全息光柵；刻線：900條/mm；激發(fā)波長范圍：240～640 nm；波長精度：±1.5 nm；分辨率：0.1 m；靈敏度：100；儀器靈敏度：H；輸出信號(hào)衰減：16；掃描速率：600 nm/min。儀器經(jīng)過改裝，將激發(fā)單色儀和發(fā)射單色儀旋鈕連至2 臺(tái)步進(jìn)電機(jī)，步進(jìn)電機(jī)采用數(shù)控軟件自動(dòng)控制電機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)速率和停留位置，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)掃描。在不同激發(fā)波長和不同波長間隔（10～170 nm）范圍內(nèi)同時(shí)進(jìn)行掃描，每間隔10 nm在N3000色譜工作站進(jìn)行1 次數(shù)據(jù)采集。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 7.0軟件，以波長間隔激發(fā)和波長為橫、縱坐標(biāo)軸，結(jié)合相對(duì)熒光強(qiáng)度繪制同步熒光等高線指紋光譜圖。使用Unscrambler 9.8軟件繪制二維圖譜并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同品種橙汁識(shí)別

2.1.1稀釋質(zhì)量分?jǐn)?shù)及掃描波長差確定

以臍橙汁5%的稀釋液及原液的同步熒光光譜二維圖即對(duì)應(yīng)圖1A和1B為例分析：圖1A在波長差為30 nm時(shí)峰形完整，強(qiáng)度適宜，波長差為10、20 nm時(shí)由于程序設(shè)置原因出現(xiàn)了平頭；波長差大于30 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度都很低且相互堆疊不能確定峰位置。而圖1B即橙汁原液在波長間隔為10、20、30 nm時(shí)都出現(xiàn)平頭峰，40 nm時(shí)峰形良好但是強(qiáng)度低（100），綜合考慮對(duì)于臍橙汁選用5%的稀釋液及在波長差為30 nm時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)剩余的其他6 種原料進(jìn)行同樣操作，都有相似規(guī)律。故對(duì)所有原料都采用5%稀釋液及波長差30 nm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 2 種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)臍橙汁同步熒光光譜圖Fig.1 Synchronous fl uorescence spectra of different concentrations of navel orange juice

圖1A即5%臍橙汁同步熒光光譜圖中，在約280、380、460 nm波長處各有一個(gè)熒光峰。

圖 22 VVBB2（aa）、VVBB6（b）、黃酮類母核（cc）結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The parent structures of VB2， VB6and fl avonoids

依據(jù)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，此3 種物質(zhì)都有共軛雙鍵體系且都是剛性的平面結(jié)構(gòu)，見圖2，VB2和VB6環(huán)上的取代基大部分為給電子基團(tuán)所以都會(huì)產(chǎn)生熒光。依據(jù)羰基類化合物和不飽和含氮化合物及芳香族化合物的紫外-可見吸收光譜可知，280 nm波長附近的吸收峰應(yīng)是橙汁中所含的橙皮苷類黃酮物質(zhì)所有，380 nm為VB6吸收波長，460 nm是VB2吸收波長。VB2吸收波長大于VB6，是因?yàn)閂B2的共軛體系遠(yuǎn)大于VB6，使π-π*躍遷能量降低導(dǎo)致熒光峰值波長紅移［23-25］。

2.1.2不同品種橙汁來源識(shí)別

圖3　7 種橙汁同步熒光光譜圖Fig.3 Synchronous fl uorescence spectra of seven orange juices

由圖3 A、B可知，臍橙和某品牌果汁同步熒光光譜等高線圖圖形很相似，在設(shè)定的激發(fā)波長（240～640 nm）范圍內(nèi)都有熒光吸收。都只在一個(gè)強(qiáng)的熒光吸收峰，前者位于350～525 nm之間后者位于325～540 nm之間，且波長間隔都在20～30 nm之間。

圖3E、D即對(duì)應(yīng)蘆柑和金橘，二者的同步熒光光譜等高線圖圖形也接近。同圖3A、B一樣在設(shè)定的激發(fā)波長（240～640 nm）范圍內(nèi)都有熒光吸收，也都只有一個(gè)強(qiáng)熒光吸收峰。但是相比于圖3A、B，圖3C、D熒光峰處的波長間隔較小，為20～23 nm。圖3C的熒光峰激發(fā)波長在360～510 nm之間，圖3D位于350～520 nm之間。

圖4　不同原料的55%果汁二維同步熒光光譜圖Fig.4 Two-dimensional synchronous fl uorescence spectra of 5% juices from different fruits

蘆柑、蜜橙和贛南橙的等高線圖相較于上面4 種材料在熒光峰處基本已分化為2 個(gè)峰，且前2 者中心位置都在約380、460 nm波長處，而贛南橙在400、475 nm波長附近。這與圖4所給出的信息相呼應(yīng)。之所以在A、B、C、D、4 種橙汁中沒有分開，是因?yàn)檫@2 個(gè)峰間隔近且峰強(qiáng)相等，而且可能由于此4 種橙汁中VB2、VB6含量相對(duì)較多、且分子支鏈取代基不同導(dǎo)致一峰藍(lán)移一峰紅移，而使兩峰距離更加接近，還由于掃描速率快從而使兩峰難以分開。

表1　不同橙汁光譜特征參數(shù)Table 1 Spectral characteristic parameters of orange juices

圖4中280 nm附近的黃酮熒光峰臍橙、金橘、蘆柑3 種橙汁較另4 種橙汁明顯，可能由于前3 者中黃酮含量高所致。其中贛南橙的峰位向右平移20 nm，見表1?？赡苁瞧贩N不同導(dǎo)致。此峰在指紋圖譜中沒有顯示出來與其熒光強(qiáng)度弱以及作圖軟件平滑處理有關(guān)。

由上述同步熒光指紋圖、二維圖及從中提取的特征值數(shù)據(jù)表可以看出7 種橙汁很相似，但各有細(xì)微特點(diǎn)?？山柚@些細(xì)微特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來源橙汁的鑒別分析。此外，也可看出市售的匯源橙汁沒有摻雜摻假及防腐劑等物質(zhì)，在熒光分析中符合鮮榨橙汁的規(guī)律。

2.2PCA

圖5　6 種橙汁同步熒光光譜數(shù)據(jù)PCAA圖Fig.5 PC1-PC2 score plot from PCA analysis for six orange juices

按照前面的分析，在激發(fā)波長240～640 nm，波長間隔為30 nm條件下進(jìn)行光譜采集以得到數(shù)據(jù)來進(jìn)行PCA。圖5結(jié)果顯示前2 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到100%，說明前2 個(gè)主成分包含了全部光譜數(shù)據(jù)所具有的信息，可將其中橙汁完全分開。圖5中A、B、C果汁、丑柑汁、贛南橙汁都分布在PC1軸方向上得分為負(fù)。D、E臍橙汁和蜜橙汁及金橘汁與前三者相反，在正方向上。因此，可先分成2 類。且對(duì)于A、B、C在PC2方向上：B和C一個(gè)為正一個(gè)為負(fù)，很容易區(qū)分，A在二者之間接近PC2的零點(diǎn)。所以這三者可以很好地分開。D金橘和E也有相似的趨勢(shì)，所以利用PCA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)橙汁的同步熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行先聚類，再利用類群分布位置進(jìn)行很好地區(qū)分。

3　結(jié) 論

根據(jù)熒光與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，理論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明橙汁中含VB2和VB6、黃酮類等熒光物質(zhì)。某品牌橙汁與鮮榨橙汁熒光特性一致，這可能是由于沒有添加檸檬酸、山梨酸鉀、苯甲酸鈉等熒光性添加劑而加入的是無熒光性質(zhì)添加劑或者是添加量太低，此法檢測(cè)不出，也有可能是其中沒有加入添加劑［26］。用PCA對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每種橙汁聚類都很明顯，可以根據(jù)其在得分圖中的聚類位置對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以為鮮榨橙汁的檢測(cè)提供參考，若是三精水或者稀釋果汁其熒光圖譜會(huì)與上述的不同或者峰值處熒光強(qiáng)度顯著變化，也可為其他飲料類食品的品質(zhì)檢測(cè)提供一個(gè)思路。

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Synchronous Fluorescence Spectroscopy Combined with Principal Component Analysis to Identify Orange Juice Quality

ZHANG Xiaoli， MAO Lixin， FAN Sanhong*
（College of Life Sciences， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Synchronous fluorescence scanning was conducted on freshly prepared orange juice and commercial orange juice to obtain the three-dimensional fl uorescence spectra. Three groups of characteristic peaks were obtained and based on their fl uorescence characteristics， these peaks were identifi ed as VB2， VB6and fl avonoids， respectively. At the same time，the synchronous fl uorescence spectral data of all the orange juice samples obtained by scanning at excitation wavelengths of 240-640 nm with a wavelength difference of 30 nm compared to the emission wavelength were analyzed using principal component analysis （PCA）. Quite good results were obtained showing that the combination of fl uorescence spectroscopy and spectral pattern recognition method can provide the powerful technical support for the identifi cation of orange juice quality. Key words: orange juice； synchronous fl uorescence spectrometry； principal component analysis （PCA）

TS225.1

A

1002-6630（2015）18-0162-05

10.7506/spkx1002-6630-201518029

2014-12-18

張曉麗（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：1329757817@qq.com

范三紅（1963—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称焚A藏與加工工藝。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn