盧可可，鄭少杰，吳素蕊，廖 霞，明 建，3，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黑脈羊肚菌多酚純化工藝及其抗氧化活性

盧可可1，鄭少杰1，吳素蕊2，廖 霞1，明 建1，3，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

以吸附率和解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究9種大孔吸附樹脂對(duì)黑脈羊肚菌多酚吸附及解吸性能，采用響 應(yīng)面法建立NKA-Ⅱ樹脂純化黑脈羊肚菌多酚的二次多項(xiàng)回歸模型，對(duì)多酚的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，并比較純化前后多酚的抗氧化活性。結(jié)果表明：最佳純化樹脂為NKA-Ⅱ。吸附的最佳工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度295.86 μg/mL、上樣流速1.90 mL/min、上樣液pH 2.84，解吸的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78.56%、洗脫速率0.80 mL/min、洗脫劑pH 3.08；在此條件下吸附率可達(dá)98.69%，解吸率可達(dá)92.75%，純化前后羊肚菌多酚純度提高了2.94倍。黑脈羊肚菌多酚純化前1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、2，2'-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽自由基清除率和還原力EC50值分別為1.48、0.015、2.35 mg/mL，純化后分別為0.52、0.004、0.69 mg/mL，純化后抗氧化活性明顯增強(qiáng)。

黑脈羊肚菌多酚；大孔吸附樹脂；NKA-Ⅱ；響應(yīng)面；抗氧化活性

黑脈羊肚菌（Morchella angusticepes Peck）屬盤菌目（Pezizales）羊肚菌屬（Morchella），主要分布于我國(guó)云南、四川、新疆、甘肅、西藏、青海等地［1］，歐洲及北美東部亦有分布［2］，是一種名貴的野生食藥用真菌。黑脈羊肚菌富含蛋白質(zhì)、維生素及多種必需氨基酸，并含有鉀、鈉、鈣、鎂和鋅、鐵等多種常量和微量元素［3］。有研究表明黑脈羊肚菌多酚含量豐富，能清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基（ABTS+·），具有一定的抗氧化能力［4］。

許多功能活性研究都圍繞羊肚菌多酚粗提物進(jìn)行，并未去除蛋白質(zhì)和糖等雜質(zhì)，對(duì)多酚含量及活性測(cè)定都會(huì)造成干擾。因此，純化是進(jìn)一步研究多酚功能及構(gòu)效的重要步驟。常用的多酚純化方法有薄層色譜［5］、固相萃?。?］（C18和聚合物）、柱層析法（硅膠柱［7］、聚酰胺柱［8］、羥丙基葡聚糖凝膠柱（Sephadex LH-20）［9］和大孔吸附樹脂［10］）、制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［11］等，而大孔吸附樹脂具有選擇性強(qiáng)、吸附容量大、吸附速率快、解吸容易、成本低、易再生等優(yōu)點(diǎn)，成為多酚類物質(zhì)純化常用柱材［12］。

目前，大孔吸附樹脂純化植物多酚的研究［13-15］較多，但是由于不同植物多酚組成不同，極性強(qiáng)弱不同，所適用的大孔吸附樹脂可能會(huì)有一定差異，而關(guān)于大孔吸附樹脂純化羊肚菌多酚研究還未有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)比較9種大孔吸附樹脂對(duì)羊肚菌多酚的吸附和解吸性能，篩選羊肚菌多酚純化的最佳樹脂；采用響應(yīng)面法優(yōu)化純化工藝，評(píng)價(jià)純化前后多酚的抗氧化活性，為進(jìn)一步研究黑脈羊肚菌多酚提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑脈羊肚菌（Morchella angusticepes Peck）產(chǎn)自云南，由中華全國(guó)供銷總社昆明食用菌研究所提供。

D101、D4020、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、AB-8、S-8大孔吸附樹脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；XAD-16、聚酰胺大孔樹脂 上海摩速科學(xué)器材有限公司；DPPH、VC、ABTS 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；XHF-D均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；5810型臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DW-FL270超低溫（-40 ℃）冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱溫科技有限責(zé)任公司；722分光光度計(jì) 上海精科科學(xué)儀器廠；KQ-100型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PB-10 pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；HZQ-F100型恒溫?fù)u床 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Φ1.84 cm×40 cm玻璃層析柱 重慶駿偉廣生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1材料預(yù)處理

黑脈羊肚菌采摘后12 h內(nèi)速凍，于-20 ℃條件下凍藏，實(shí)驗(yàn)前取出冷凍羊肚菌于50 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩后密封備用。大孔吸附樹脂預(yù)處理參考安曉婷等［16］方法。

1.3.2樣品液制備和質(zhì)量濃度測(cè)定

將40 g羊肚菌粉參考Okarter［17］和盧可可［18］等的方法提取，得樣品液，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后貯于-40 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Chu等［19］的方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 9x+0.013 4（R2=0.996 7），其中y為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL），x為吸光度，根據(jù)該方程計(jì)算樣品液多酚質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3.3樹脂的篩選

參考陳曉俠等［20］的方法，分別繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線和靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線，測(cè)定濾液中多酚含量。分別測(cè)定樹脂的吸附量、解吸量、吸附率、解吸率，篩選最佳樹脂。

1.3.4大孔樹脂純化羊肚菌多酚條件優(yōu)化［16］

通過(guò)靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳純化樹脂，將預(yù)處理的該樹脂裝入玻璃層析柱中，柱床體積BV為90 mL，用3 BV乙醇過(guò)柱洗滌后，用2 mL/min水平衡12 h。

1.3.4.1動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化

1）上樣流速對(duì)吸附效果的影響：將質(zhì)量濃度為267.7 μg/mL的樣品液，在自然酸度pH 5.10條件下，各取250 mL，分別以1、2、3、4、5 mL/min流速通過(guò)層析柱，計(jì)算吸附率。2）上樣液pH值對(duì)吸附效果的影響：用5% HCl溶液將質(zhì)量濃度為220.7 μg/mL的樣品液pH值分別調(diào)至2、3、4、5、6這5 個(gè)水平，各取上述溶液250 mL，以2 mL/min的流速通過(guò)層析柱，計(jì)算吸附率。3）上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響：分別取250 mL質(zhì)量濃度分別為200、300、400、500、600 μg/mL的多酚提取液，用5% HCl溶液調(diào)至pH 3.0，以2 mL/min的流速通過(guò)層析柱，計(jì)算吸附率。

1.3.4.2動(dòng)態(tài)解吸條件優(yōu)化

1）洗脫速率對(duì)解吸效果的影響：將吸附飽和的樹脂裝入5 根層析柱中，先用1 BV水過(guò)柱洗脫，再用60%乙醇溶液在自然酸度條件下，分別以1、2、3、4、5 mL/min流速通過(guò)層析柱，計(jì)算解吸率。2）洗脫劑pH值對(duì)解吸效果的影響：將吸附飽和的樹脂裝入5 根層析柱中，先用1 BV水過(guò)柱洗脫，再用5% HCl溶液將60%乙醇溶液pH值分別調(diào)至2、3、4、5、6這5 個(gè)水平，以1 mL/min的流速通過(guò)層析柱，計(jì)算解吸率。3）洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響：將吸附飽和的樹脂裝入5根層析柱中，先用1 BV水過(guò)柱洗脫，再用5% HCl溶液將體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液洗脫劑調(diào)至pH 3.0，以1 mL/min的流速通過(guò)層析柱，計(jì)算解吸率。

1.3.4.3響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化樹脂純化多酚工藝［21］

采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert中響應(yīng)面方法的Box-Behnken模型，以上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速及上樣液pH值3 個(gè)因素為吸附操作中的自變量，以吸附率為響應(yīng)值，因素水平見表1。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫速率及洗脫劑pH值3 個(gè)因素為解吸操作中的自變量，以解吸率為響應(yīng)值，因素水平見表2。

表1　吸附試驗(yàn)自變量因素編碼及水平Table 1 Codes and levels of factors chosen for adsorption experiments

表2　解吸試驗(yàn)自變量因素編碼及水平Table 2 Codes and levels of factors chosen for desorption experiments

1.3.5羊肚菌多酚抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定：參考Cheung等［22］的方法測(cè)定；還原力測(cè)定：參考Ardestani等［23］的方法測(cè)定；ABTS+·清除率測(cè)定：參考Soong等［24］的方法測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0和Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用表示。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳樹脂型號(hào)的篩選

圖1　不同型號(hào)樹脂靜態(tài)吸附（A）和解吸（B）動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static absorption and desorption kinetics curves for different resins

由圖1可知，9 種樹脂對(duì)羊肚菌多酚均具有較好的吸附和解吸性能，均能在較短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)羊肚菌多酚的吸附和解吸作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線逐漸平緩，10 h左右吸附和解吸作用基本達(dá)到平衡。不同型號(hào)樹脂對(duì)羊肚菌多酚的吸附性能和解吸性能有所差異，極性樹脂NKA-Ⅱ和S-8的吸附率始終優(yōu)于其他樹脂；樹脂D101、XAD-16、AB-8和NKA-Ⅱ的解吸率高于其他樹脂。

表3　不同型號(hào)樹脂的吸附和解吸能力比較Table 3 Comparisons of absorption and desorption capacities of different macroporous resins

由表3可知，NKA-Ⅱ?qū)ρ蚨蔷喾游搅孔罡邽椋?.357±0.059）mg/g干樹脂，其次是S-8為（5.121±0.457）mg/g干樹脂，但二者間差異不顯著（P＜0.0 5）；而二者的吸附率分別為（52.800±0.099）%和（50.515±1.987）%，差異顯著（P＜0.05）。此外，X-5、XAD-16和NKA-9對(duì)羊肚菌多酚的吸附性能也較好，吸附量均超過(guò)3 mg/g干樹脂。根據(jù)類似物易吸附類似物的原理，非極性吸附樹脂因表面的疏水作用，可通過(guò)與有機(jī)物的疏水部分作用而吸附溶液中的有機(jī)物，最適合于從極性溶劑（如水）中吸附非極性物質(zhì)；中極性吸附樹脂表面兼有疏水和親水部分，既可從極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也可從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)；極性和強(qiáng)極性吸附樹脂一般通過(guò)靜電作用吸附極性物質(zhì)［25］。羊肚菌及其他食用菌中多酚組分主要以酚酸類物質(zhì)為主［18，26］，因此極性較強(qiáng)，所以極性強(qiáng)的NKA-Ⅱ和S-8樹脂對(duì)羊肚菌多酚的吸附效果較好。

9種樹脂對(duì)羊肚菌多酚的解吸性能實(shí)驗(yàn)中，D101、XAD-16、AB-8和NKA-Ⅱ解吸率均較大，均達(dá)到80%以上。綜合考慮大孔吸附樹脂對(duì)羊肚菌多酚的吸附量與解吸率結(jié)果，選擇NKA-Ⅱ作為純化黑脈羊肚菌多酚的最佳樹脂。

2.2NKA-Ⅱ型樹脂的動(dòng)態(tài)吸附解吸條件優(yōu)化

2.2.1動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.2.1.1上樣流速對(duì)吸附效果的影響

圖2　上樣流速對(duì)吸附效果的影響Fig.2 Infl uence of sample loading fl ow rate on absorption effi ciency

羊肚菌多酚是一類大分子酚類化合物，在大孔吸附樹脂間擴(kuò)散較慢，如果上樣流速過(guò)大，多酚類物質(zhì)還未被樹脂吸附就流出樹脂柱，導(dǎo)致吸附率變低；但如果速率太低，操作時(shí)間較長(zhǎng)。由圖2可知，當(dāng)上樣流速增加到3 mL/min時(shí)，吸附率明顯減小，因此綜合考慮，上樣流速應(yīng)控制在2 mL/min。

2.2.1.2上樣液pH值對(duì)吸附效果的影響

圖3　上樣液pH值對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Infl uence of sample pH on absorption effi ciency

上樣液pH值會(huì)影響多酚在溶液中存在的形式、其溶解度以及溶液極性，從而影響多酚與大孔吸附樹脂的分子間作用力［27］。羊肚菌多酚主要以酚酸類物質(zhì)［18］，呈一定的酸性，由于酸性化合物在酸性溶液中易被吸附，堿性化合物在堿性條件下易被吸附。因此，在酸性條件下有利于大孔吸附樹脂對(duì)羊肚菌多酚的吸附。由圖3可知，在pH 2和pH 3時(shí)，吸附率較大，與其他文獻(xiàn)［28］報(bào)道相符合。但當(dāng)pH 2時(shí)溶液中有少許沉淀出現(xiàn)，因此，上樣液pH值控制在3。

2.2.1.3上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

圖4　上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響Fig.4 Infl uence of sample solution concentration on absorption effi ciency

由圖4可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，吸附率逐漸增大，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，吸附率達(dá)到最大，達(dá)96.91%，超過(guò)該質(zhì)量濃度時(shí)，吸附率減小，因?yàn)楫?dāng)上樣液質(zhì)量濃度較低時(shí)，即使出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，可能有些樹脂還未達(dá)到飽和，增大質(zhì)量濃度，在吸附過(guò)程中多酚與樹脂接觸幾率增大，從而利于多酚向樹脂擴(kuò)散；但當(dāng)質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，與多酚競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)量也隨之增加，且速率恒定時(shí)，高質(zhì)量濃度不利于多酚在樹脂間的擴(kuò)散。因此，上樣液質(zhì)量濃度控制在300 μg/mL。

2.2.2動(dòng)態(tài)解吸條件優(yōu)化

2.2.2.1洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響

圖5　洗脫速率對(duì)解吸效果的影響Fig.5 Infl uence of desorption fl ow rate on desorption effi ciency

如圖5所示，解吸率與洗脫速率呈負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)樗俾蕰?huì)影響洗脫劑與吸附在樹脂上的多酚類物質(zhì)間的交換，洗脫速率過(guò)快，洗脫劑不能充分置換吸附在樹脂上的多酚類物質(zhì)，從而導(dǎo)致解吸率降低。因此，洗脫速率選擇1 mL/min。

圖6　洗脫劑pH值對(duì)解吸效果的影響Fig.6 Infl uence of eluent pH on desorption effi ciency

2.2.2.2洗脫劑pH值對(duì)洗脫效果的影響如圖6所示，隨著洗脫劑pH值的降低，解吸率逐漸增大，當(dāng)pH3時(shí)解吸率達(dá)到最大為90.24%，繼續(xù)降低pH值，解吸率反而降低。與吸附作用相同，酸性條件有利于NKA-Ⅱ樹脂吸附的羊肚菌多酚類物質(zhì)的解吸。綜合考慮，洗脫劑pH值應(yīng)控制在3。

2.2.2.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響

圖7　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響Fig.7 Infl uence of ethanol concentration on desorption effi ciency

由圖7可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率逐漸升高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，解吸率僅為46.25%，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，解吸率最高達(dá)91.69%，繼續(xù)增大體積分?jǐn)?shù)，解吸率反而下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.2.3動(dòng)態(tài)吸附工藝優(yōu)化及模型的建立

在NKA-Ⅱ型大孔吸附樹脂吸附羊肚菌多酚的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，以考察各因素間的交互作用及優(yōu)化最佳吸附工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表4　NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results for dynamic absorption process of NKA-II

對(duì)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到NKA-Ⅱ型大孔吸附樹脂吸附羊肚菌多酚吸附率對(duì)自變量上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速、上樣液pH值的二次多項(xiàng)回歸模型方程（1）。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5，可知，模型F=148.75＞F0.01（9，4）=14.66，模型P＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；F失擬=0.11＜F0.05（9，3）=8.1，失擬項(xiàng)P=0.950 4＞0.05，模型失擬度不顯著；模型的校正決定系數(shù)為0.988 1，說(shuō)明該模型能解釋98.81%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的1.19%，不能用此模型來(lái)解釋；復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.994 8，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。

表5　吸附試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation for the adsorption experiment

表6　吸附試驗(yàn)回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Signifi cance test of regression coeffi cients for the adsorption experiment

對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。模型中一次項(xiàng)X2、X3，二次項(xiàng)以及交互項(xiàng)X1X3、X2X3對(duì)吸附率Y有顯著或極顯著影響，其余項(xiàng)的影響均不顯著（P＞0.05）。其中，上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速、上樣液pH值對(duì)吸附率影響順序?yàn)椋荷蠘右簆H值＞上樣流速＞上樣液質(zhì)量濃度。優(yōu)化回歸模型為：

為了直觀反映各因素對(duì)吸附率的影響及最佳工藝參數(shù)和參數(shù)間的交互作用，用響應(yīng)面及其等高線圖表示，由表6可知，X1X3、X2X3對(duì)Y的影響顯著，如圖8所示，而X1X2對(duì)Y的影響不顯著。

圖8　因素交互作用對(duì)吸附率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots for the interactive effects of factors on adsorption rate

如圖8a所示，曲面為固定上樣流速為2 mL/min情況下，不同上樣液質(zhì)量濃度和上樣液pH值對(duì)吸附率的影響情況，二者交互作用顯著（P＜0.05）。上樣液pH值不變，上樣液質(zhì)量濃度在250～350 μg/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，樹脂對(duì)羊肚菌多酚的吸附率即響應(yīng)值Y先增大后減小，在300 μg/mL附近時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度不變時(shí)，隨著上樣液pH值的升高，響應(yīng)值Y先增大后減小，在pH 2.7～2.9間取得最大值。如圖8b所示，曲面為固定上樣液質(zhì)量濃度為300 μg/mL情況下，不同上樣流速和上樣液pH值對(duì)吸附率的影響情況，二者交互作用顯著（P＜0.05）。上樣液pH值不變，上樣流速在1.5～2.5 mL/min范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著流速的增大，響應(yīng)值Y先增大后減小，但變化趨勢(shì)不明顯；當(dāng)上樣流速不變時(shí)，隨著上樣液pH值的升高，響應(yīng)值Y先增大，后急劇減小。

利用Design-Expert軟件解模型方程（1）的逆矩陣，求得吸附率的最大預(yù)測(cè)值為99.09%，此時(shí)最佳工藝為上樣液質(zhì)量濃度295.86 μg/mL、上樣流速1.90 mL/min、上樣液pH 2.84；取最佳工藝的近似值，即上樣質(zhì)量濃度295.00 μg/mL、上樣流速1.90 mL/min、上樣液pH 2.80進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到吸附率為98.69%，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為0.41%，說(shuō)明該回歸模型優(yōu)化的工藝組合是有效的。

2.2.4動(dòng)態(tài)解吸工藝優(yōu)化及模型的建立

在解吸單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，以考察各因素間的交互作用及優(yōu)化最佳解吸工藝，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7　NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)解吸優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 Experimental design and results for dynamic desorption process of NKA-Ⅱ

對(duì)表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到解吸率對(duì)自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫速率、洗脫劑pH值的二次多項(xiàng)回歸模型方程（2）。

表8　解吸試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of regression equation for the desorption experiment

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8，可知，模型F=25.12＞F0.01（9，4）=14.66，模型P=0.000 2，表明該回歸模型極顯著；F失擬=2.75＜F0.05（9，3）=8.1，失擬項(xiàng)P=0.176 9＞0.05，模型失擬度不顯著；模型的校正決定系數(shù)為0.931 4，說(shuō)明該模型能解釋93.14%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的6.86%，不能用此模型來(lái)解釋；復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.970 0，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。

表9　解吸試驗(yàn)回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 9 Signifi cance test of regression coeffi cients for the desorption experiment

對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表9。模型中一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2以及交互項(xiàng)AB對(duì)解吸率Y'有顯著或極顯著影響，其余項(xiàng)的影響均不顯著（P＜0.05）。其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫速率、洗脫劑pH對(duì)解吸率影響順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞洗脫劑pH值＞洗脫速率。優(yōu)化回歸模型為：Y'/%=92.75-4.76A-2.70B+ 2.84C-3.12AB-12.09A2-6.00C2。

圖9　乙醇體積分?jǐn)?shù)和洗脫速率交互作用對(duì)解吸率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface and contour plots for the effects of ethanol concentration， fl ow rate and their interaction on desorption rate

A與B對(duì)Y'的交互作用如圖9所示，在固定洗脫劑pH 3情況下，當(dāng)速率不變，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～90%范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，洗脫劑對(duì)羊肚菌多酚的解吸率即響應(yīng)值Y'先增大后大幅度減?。划?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不變時(shí)，隨著洗脫速率的增大，響應(yīng)值Y'變化趨勢(shì)不明顯。

利用Design-Expert軟件解模型方程（2）的逆矩陣，求得解吸率的最大預(yù)測(cè)值為93.84%，此時(shí)最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)78.56%、洗脫速率0.80 mL/min、洗脫劑pH 3.08；取最佳工藝的近似值，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、洗脫速率0.80 mL/min、洗脫劑pH 3.00進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到解吸率為92.75%，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為1.17%，說(shuō)明該回歸模型優(yōu)化的工藝組合是有效的。

2.3NKA-Ⅱ樹脂的動(dòng)態(tài)洗脫性能曲線

圖10　動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.10 Dynamic elution curve

由圖10可知，動(dòng)態(tài)條件下，NKA-Ⅱ樹脂上吸附的羊肚菌多酚易被洗脫下來(lái)，洗脫液體積為0.5～1.5 BV時(shí)，洗脫液中羊肚菌多酚含量較多，洗脫峰比較集中，達(dá)到3 BV時(shí)，洗脫液中幾乎沒(méi)有多酚物質(zhì)，因此解吸時(shí)洗脫體積選擇3 BV即可。

2.4羊肚菌多酚大孔吸附樹脂純化前后抗氧化活性

引入半數(shù)抑制率EC50值作為DPPH自由基清除能力、還原力和ABTS+·清除能力的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［29］，EC50值越小，說(shuō)明抗氧化劑的抗氧化效果越好。黑脈羊肚菌純化前后多酚純度及DPPH自由基清除率、ABTS+·清除率和還原力的EC50值見表10。

表10　羊肚菌多酚純化前后純度及抗氧化活性比較Table 10 Comparison of antioxidant activities and purities of polyphenol before and after purifi cation

由表10可知，經(jīng)NKA-Ⅱ樹脂純化后，羊肚菌多酚純度從純化前（23.75±0.41）mg/g粗提物達(dá)到（93.74±2.14）mg/g，純度提高了2.94倍；純化后EC50值也有所降低。說(shuō)明純化后羊肚菌多酚抗氧化活性明顯增強(qiáng)。

3　結(jié) 論

通過(guò)比較9種大孔吸附樹脂對(duì)黑脈羊肚菌多酚的靜態(tài)吸附與解吸性能，確定NKA-Ⅱ型樹脂最適于純化羊肚菌多酚；再利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert，優(yōu)化了NKA-Ⅱ樹脂純化黑脈羊肚菌多酚的吸附、解吸工藝條件，建立了各因素及響應(yīng)值間的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，根據(jù)響應(yīng)面圖和等高線圖對(duì)關(guān)鍵因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果表明：吸附各因素對(duì)吸附率的影響順序?yàn)樯蠘右簆H值＞上樣流速＞上樣液質(zhì)量濃度；解吸各因素對(duì)解吸率的影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞洗脫劑pH值＞洗脫速率；吸附的最佳條件為上樣液質(zhì)量濃度295.86 μg/mL、上樣流速1.90 mL/min、上樣液pH 2.84，解吸的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78.56%、洗脫速率0.80 mL/min、洗脫劑pH 3.08；在此條件下吸附率可達(dá)98.69%，解吸率可達(dá)92.75%，只需3 BV洗脫劑就能將其基本洗脫，純化前后羊肚菌多酚純度約提高3倍；黑脈羊肚菌多酚具有一定的抗氧化活性，純化前DPPH自由基清除率、ABTS+·清除率和還原力EC50值分別為1.48、0.015、2.35 mg/mL，純化后分別為0.52、0.004、0.69 mg/mL，純化后抗氧化活性明顯增強(qiáng)。

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Optimization of Purifi cation Process of Polyphenol from Morchella angusticepes Peck and Antioxidant Activity of the Extracted Polyphenol

LU Keke1， ZHENG Shaojie1， WU Surui2， LIAO Xia1， MING Jian1，3，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Kunming Research Fungi Institute， All-China Federation of Supply and Marketing Cooperatives， Kunming 650223， China；3. Chongqing Speci al Food Program and Technology Research Center， Chongqing 400715， China）

Nine macroporous resins were investigated with respect to their adsorption and desorption rates for the polyphenol extracted from Morchella angusticepes Peck in order to find the most appropriate one. Response surface methodology was utilized to establish a mathematical regression model for optimizing the purifi c ation of the crude extract by adsorption column chromatography with the selected resin. NKA-Ⅱ was found to be the most suitable resin for the purifi cation of polyphenol. The optimum conditions for purifi cation we re obtained when the sample containing 295.86 μg/mL polyphenol at pH 2.84 was loaded onto the column at a fl ow rate of 1.90 mL/min， and then eluted with 78.56% aqueous ethanol acidifi ed to pH 3.08 at a fl ow rate of 0.80 mL/min. The purifi cation process yielded an adsorption rate of 98.69%， a desoprtion rate of 92.75% and a purifi cation factor of approximately 4. The half maximal effective concentrations （EC50） for DPPH and ABTS radical scavenging capacities and reducing power of the crude extract were 1.48， 0.015 and 2.35 mg/mL and reduced to 0.52， 0.004 and 0.69 mg/m L after the purifi cation， suggesting a signifi cant increase in the antioxidant activities.

polyphenols from Morchella angusticepes Peck； macroporous resin； NKA-Ⅱ； response surface methodology；antioxidant activity

R151.2

A

1002-6630（2015）18-0013-08

10.7506/spkx1002-6630-201518003

2015-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471576）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD16B01）

盧可可（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：lukeke8868@163.com

明建（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com