秦 昱，邵元元，熊 碩，滕 杰，豐金玉，肖文軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

秦 昱，邵元元，熊 碩，滕 杰，豐金玉，肖文軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

以沒食子酸為材料，通過考察酶質(zhì)量濃度、反應(yīng)體系中底物和酶及沒食子酸添加順序、不同反應(yīng)時(shí)間、不同沒食 子酸質(zhì)量濃度對(duì)豬胰α-淀粉酶、蛋白酶的活性影響，研究沒食子酸對(duì)兩種酶的 抑制作用。結(jié)果表明，在底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL、體系添加順序?yàn)槊敢号c抑制劑沒食子酸溶液37 ℃預(yù)溫5 min后加入底物溶液的條件下，沒食子酸抑制豬胰α-淀粉酶活性最優(yōu)條件為：α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.64 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間15 min，沒食子酸對(duì)α-淀粉酶的最大抑制率為95.52%；在體系添加順序?yàn)槊敢号c抑制劑沒食子酸溶液40 ℃預(yù)溫5 min后加入底物溶液的條件下，沒食子酸抑制豬胰蛋白酶活性的最優(yōu)條件為：胰蛋白酶質(zhì)量濃度0.63 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間30 min，沒食子酸對(duì)胰蛋白酶的最大抑制率為99.24%。沒食子酸對(duì)兩種酶的抑制效果均隨沒食子酸質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。

沒食子酸；豬胰α-淀粉酶；豬胰蛋白酶；抑制作用

沒食子酸為3，4，5-三羥基苯甲酸，具有抗炎［1］、抑菌［2］、抗氧化［3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［5］、殺錐蟲［6］等多種生物學(xué)活性，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、有機(jī)合成、輕工及電子等行業(yè)［7-10］。研究表明，對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶類的抑制作用是探討降糖降脂作用機(jī)理的一種有效方法［11］，利用α-淀粉酶抑制劑開發(fā)的新型口服抗糖尿病藥物，可以降低血糖和血脂水平，防治糖尿病、高血脂、肥胖癥等疾?。?2］。胰蛋白酶抑制劑在臨床上主要用于治療急性胰腺炎、心腦血管疾病、抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移等［13］，相關(guān)資料表明，胰蛋白酶抑制劑也具有降糖降脂活性［14-15］。有研究利用碘-淀粉比色法探討沒食子酸對(duì)α-淀粉酶活性的影響作用［11，16］，但就其影響作用究竟是抑制還是促進(jìn)效果未能得出一致結(jié)論，同時(shí)，當(dāng)前尚未見有關(guān)沒食子酸對(duì)胰蛋白酶活性影響的研究報(bào)道。因此，深入研究沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用，揭示其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用效果，將對(duì)沒食子酸的開發(fā)利用和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

沒食子酸（純度≥98%，批號(hào)：NO.20120914）湖南張家界奧威生物科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（A3176，500 U/mg）、豬胰蛋白酶（T4799，1 000～2 000 BAEE units/mg） 美國Sigma公司；拜唐平拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

3，5-二硝基水楊酸（3，5-nitro salicylic acid，DNS）溶液、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液分別為終止α-淀粉酶和蛋白酶反應(yīng)的終止劑。

1.2儀器與設(shè)備

AUW220D精密電子天平 日本島津公司；pHS22C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；SK3300LH超聲波清洗器上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3方法

沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶及胰蛋白酶的抑制作用采用非連續(xù)測(cè)定和作圖法，α-淀粉酶酶活力測(cè)定參照Bernfeld法［17-18］進(jìn)行，胰蛋白酶酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)［19］方法，IC50的計(jì)算采用SPSS軟件中Profit分析方法，其中響應(yīng)頻率為抑制劑的抑制率，協(xié)變量為抑制劑質(zhì)量濃度。

1.3.1沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶活性影響條件優(yōu)化

1.3.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取葡萄糖0.1 g，加蒸餾水定容至50 mL，配制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL，分別置于10mL容量瓶中，37 ℃預(yù)溫5 min后，各加入0.5mL DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻，加水定容至刻度。以不加葡萄糖溶液為空白，于540 nm波長處測(cè)定吸光度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 13.400 5 x+0.069 2（R2= 0.995 9）。

1.3.1.2酶質(zhì)量濃度篩選

取7 支試管，于不同試管中加入不同質(zhì)量濃度的α-淀粉酶溶液（0.16、0.32、0.48、0.64、0.80、0.96、1.12 mg/mL），與1.0 g/100 mL可溶性淀粉溶液反應(yīng)，測(cè)定不同質(zhì)量濃度α-淀粉酶與底物反應(yīng)的關(guān)系，并作圖考察，選出合適的反應(yīng)酶質(zhì)量濃度。

1.3.1.3反應(yīng)時(shí)間篩選

取5 支試管，于每根試管中分別加入一定質(zhì)量濃度的α-淀粉酶溶液，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間（5、10、15、20、25 min）下還原性糖生成量，作圖確定α-淀粉酶的最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.1.4底物、酶、抑制劑添加順序篩選

以1.3.1.3節(jié)最適反應(yīng)時(shí)間為基礎(chǔ)，將底物可溶性淀粉溶液、豬胰α-淀粉酶、抑制劑沒食子酸按以下3 種順序加入：A）可溶性淀粉溶液、α-淀粉酶、沒食子酸于37 ℃分別預(yù)熱5 min后，一起加入到試管中反應(yīng)；B）可溶性淀粉溶液與沒食子酸37 ℃預(yù)熱5 min，然后加入α-淀粉酶反應(yīng)；C）沒食子酸與α-淀粉酶37 ℃預(yù)熱5 min，然后加入可溶性淀粉溶液反應(yīng)；分析3 種方式下各抑制效果，篩選最佳添加順序。

1.3.1.5最優(yōu)條件下沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶的抑制效果

在不同試管中分別加入質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9、

11、13、15 mg/mL的沒食子酸，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)探索，酶與底物反應(yīng)體積均選0.3 mL。按表1所示添加反應(yīng)物后，沸水浴5 min，冷卻、稀釋，于540 nm波長處測(cè)定吸光度。其中，陽性對(duì)照為拜糖平溶液，背景對(duì)照為對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的抑制劑及底物溶液。α-淀粉酶抑制劑活力單位定義為：在37 ℃，pH 6.8條件下降低1 個(gè)酶活力單位為抑制劑一個(gè)抑制活力單位。

表1　豬胰-淀粉酶活性抑制體系Table1 Reaction systems for inhibition of porcine pancreatic-amylase

抑制劑對(duì)α-淀粉酶的抑制率計(jì)算公式為：

式中：A1、A2、A3、A4分別為540 nm波長處無抑制劑組、空白組、加抑制劑組和背景對(duì)照組的吸光度。

1.3.2沒食子酸對(duì)豬胰蛋白酶活性影響條件優(yōu)化

1.3.2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取L-酪氨酸0.100 g，用1 mol/L的鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1.00 mg/mL的酪氨酸溶液。吸取1.8 mL酪氨酸溶液，用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL，即得0.18 mg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。按表2順序添加后，離心，取上清液，以1號(hào)試管為空白，280 nm波長處測(cè)定吸光度，并繪制不同質(zhì)量濃度酪氨酸與吸光度的關(guān)系圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 65.944 x+0.024 9（R2= 0.998 9）。

表2　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑加入量Table2 Amounts of reagents used for preparation of tyrosine standard curve mL

1.3.2.2酶質(zhì)量濃度篩選

取6 支試管，于不同試管中加入不同質(zhì)量濃度的胰蛋白酶溶液（0.126、0.252、0.378、0.504、0.630、0.756 mg/mL），與1.0 g/100 mL酪蛋白溶液反應(yīng)，測(cè)定不同質(zhì)量濃度胰蛋白酶與底物反應(yīng)的關(guān)系，并作圖考察，選出合適的反應(yīng)酶質(zhì)量濃度。

1.3.2.3反應(yīng)時(shí)間篩選

取6 支試管，于每根試管中分別加入一定質(zhì)量濃度的胰蛋白酶溶液，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間（5、10、20、30、40、50 min）下產(chǎn)物生成量，作圖確定胰蛋白酶的最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2.4底物、酶、抑制劑添加順序篩選

以1.3.2.3節(jié)中篩選出的最適反應(yīng)時(shí)間為基礎(chǔ)，將底物酪蛋白溶液、豬胰蛋白酶、抑制劑沒食子酸按以下3 種順序加入：A）酪蛋白溶液、胰蛋白酶、沒食子酸于40 ℃分別預(yù)熱5 min后，一起加入到試管中反應(yīng)；B）酪蛋白溶液與沒食子酸40 ℃預(yù)熱5 min，然后加入胰蛋白酶反應(yīng)；C）沒食子酸與胰蛋白酶40 ℃預(yù)熱5 min，然后加入酪蛋白溶液反應(yīng)；分析3 種方式下各抑制效果，篩選最佳添加順序。

1.3.2.5最優(yōu)條件下沒食子酸對(duì)豬胰蛋白酶的抑制效果

在不同試管中分別加入質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL的沒食子酸，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)探索，酶與底物反應(yīng)體積分別選0.5 mL和1.0 mL。按表3所示添加反應(yīng)后，立即加入TCA溶液終止反應(yīng)，搖勻靜置，加蒸餾水稀釋，離心，取上清液，于280 nm波長處測(cè)定吸光度。豬胰蛋白酶抑制劑活力單位定義為：在40 ℃，pH 8.0條件下降低1 個(gè)酶活力單位為抑制劑一個(gè)抑制活力單位。

抑制劑對(duì)豬胰蛋白酶的抑制率計(jì)算公式同豬胰α-淀粉酶抑制率計(jì)算公式，公式（1）、（2）中A值均為在280 nm波長處的吸光度。

表3　豬胰蛋白酶活性抑制體系Table3 Reaction systems for inhibition of porcine pancreatic trypsin

2　結(jié)果與分析

2.1沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶酶活性抑制作用

2.1.1酶質(zhì)量濃度確定

圖1　豬胰α-淀粉酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響Fig.1 Effect of pancreatic α-amylase concentration on the enzymatic activity

由圖1可知，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，吸光度增大，淀粉酶質(zhì)量濃度在0.16～0.64 mg/mL范圍內(nèi)，有較好的線性關(guān)系，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，底物被快速消耗，酶與底物的反應(yīng)速率減慢，最終將達(dá)到平衡。由圖中可以看出，要使酶與底物保持最大反應(yīng)速率，α-淀粉酶質(zhì)量濃度選擇在0.64 mg/mL較為合適。

2.1.2反應(yīng)時(shí)間確定

圖2　最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇Fig.2 Selection of optimal reaction time

還原性糖生成量隨反應(yīng)時(shí)間變化的關(guān)系如圖2所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在0～15 min時(shí)，吸光度與時(shí)間基本呈線性關(guān)系，隨著時(shí)間延長，吸光度變化減小，還原性糖含量增長 減慢，說明在15 min內(nèi)的反應(yīng)速率可認(rèn)為近似達(dá)到初始速率。因此，體系最適反應(yīng)時(shí)間選擇15min較為合適。

2.1.3酶、底物、抑制劑（沒食子酸）添加順序確定

圖3　反應(yīng)體系中添加順序?qū)σ种谱饔玫挠绊慒ig.3 Effect of addition sequence of reactants on α-amylase inhibition

由圖3可知，沒食子酸的A、B、C 3 種加入順序的抑制率分別為25.97%、19.54%、30.36%。結(jié)果表明，A、B、C 3 種添加順序的抑制率差異不顯著（P＞0.05），從圖3可以看出順序C（沒食子酸與α-淀粉酶先進(jìn)行預(yù)熱，再加入淀粉溶液反應(yīng)）的抑制效果最佳，而順序B的抑制率相對(duì)較小，以順序C為最佳添加順序，與莊玲玲［20］、劉雯［21］等實(shí)驗(yàn)中淀粉酶抑制作用建立所用的添加順序一致。

2.1.4最優(yōu)條件下沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶的抑制效果

圖4　不同質(zhì)量濃度沒食子酸對(duì)豬胰α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of gallic acid on the activity of porcine pancreatic α-amylase

由圖4可知，不同質(zhì)量濃度的沒食子酸對(duì)α-淀粉酶活性均有一定的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制能力逐漸增強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的初始質(zhì)量濃度時(shí)，沒食子酸的抑制率最低，僅為28.27%。在質(zhì)量濃度為1～9 mg/mL區(qū)間時(shí)，沒食子酸對(duì)α-淀粉酶活性的抑制呈劑量依賴關(guān)系，抑制率隨著劑量的加大而增大。在此之后，隨樣品質(zhì)量濃度的加大，抑制率無明顯增長。當(dāng)沒食子酸單體質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到95.52%。通過測(cè)定沒食子酸對(duì)α-淀粉酶的半抑制濃度I C50，并與陽性對(duì)照藥物拜糖平對(duì)α-淀粉酶的IC50進(jìn)行比較，IC50越小，表明抑制效果越小。經(jīng)計(jì)算得到，沒食子酸對(duì)α-淀粉酶的IC50為3.01 mg/mL，拜糖平對(duì)α-淀粉酶的IC50為0.236 mg/mL。

2.2沒食子酸對(duì)豬胰蛋白酶酶活性的抑制作用

2.2.1酶質(zhì)量濃度篩選

圖5　豬胰蛋白酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effect on trypsin concentration on its activity

由圖5所示，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，吸光度增大。當(dāng)酶質(zhì)量濃度達(dá)到0.63 mg/mL時(shí)，吸光度已趨于飽和，說明酶在這一范圍內(nèi)基本反應(yīng)完全。因此，酶質(zhì)量濃度選擇在0.63 mg/mL能夠保證酶的充分反應(yīng)。

圖6　最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇Fig.6 Selection of optimal reaction time

2.2.2反應(yīng)時(shí)間的篩選酪氨酸生成量隨反應(yīng)時(shí)間變化的關(guān)系如圖6所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在0～30 min時(shí)，隨著時(shí)間的增加，酶與底物在不斷地反應(yīng)生成產(chǎn)物。30 min之后，隨著時(shí)間的延長，吸光度變化很小，說明產(chǎn)物生成速率減慢，酶與底物的反應(yīng)已較為完全。因此，體系最適反應(yīng)時(shí)間選擇30最為合適。

2.2.3酶、底物、抑制劑（沒食子酸）添加順序篩選

圖7　反應(yīng)體系中添加順序?qū)σ种谱饔玫挠绊慒ig.7 Effect of addition sequence of reactants on trypsin inhibition

由圖7可知，沒食子酸的A、B、C 3種加入順序的抑制率分別為95.91%、94.08%、94.35%。結(jié)果表明，3 種添加順序的抑制率差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)于沒食子酸來說，A、B、C 3種添加順序的抑制率十分接近，其中順序A的抑制率稍高，順序C僅比順序B高出0.27%，說明添加順序的不同對(duì)沒食子酸單體抑制作用的影響很小。為了研究沒食子酸對(duì)胰蛋白酶的抑制作用，避免底物的干擾，結(jié)合α-淀粉酶添加順序的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取順序C為添加順序。

2.2.4最優(yōu)條件下沒食子酸對(duì)豬胰蛋白酶活性的抑制作用

由圖8可知，不同質(zhì)量濃度的沒食子酸對(duì)胰蛋白酶活性均呈現(xiàn)很強(qiáng)的抑制作用。在質(zhì)量濃度僅為0.4 mg/mL時(shí)，抑制率就達(dá)到94.56%，當(dāng)質(zhì)量濃度上升到3.2 mg/mL時(shí)，其抑制率為99.24%，已無明顯增長。經(jīng)SPSS軟件分析得到，沒食子酸對(duì)胰蛋白酶的IC50為0.019 mg/mL。

圖8　不同質(zhì)量濃度沒食子酸對(duì)豬胰蛋白酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of gallic acid at various concentrations on the activity of porcine pancreatic trypsin

3　結(jié) 論

研究表明，沒食子酸對(duì)胰α-淀粉酶和胰蛋白酶均有良好的抑制效果，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的沒食子酸對(duì)α-淀粉酶活性影響效果相符［11］。當(dāng)沒食子酸質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL時(shí)，對(duì)α-淀粉酶活性最大抑制率為95.52%；當(dāng)其質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL時(shí)，對(duì)胰蛋白酶活性最大抑制率達(dá)到99.24%。本結(jié)果對(duì)沒食子酸抑制兩種胰酶的作用進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)揭示其抑制作用機(jī)理及沒食子酸調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了參考。

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Inhibitory Effect of Gallic Acid on Pancreatic α-Amylase and Trypsin

QIN Yu， SHAO Yuanyuan， XIONG Shuo， TENG Jie， FENG Jinyu， XIAO Wenjun*
（National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

The inhibitory effect of gallic acid on the activities of pancreatic α-amylase and trypsin was studied by varying enzyme concentration， the sequence of adding substrate， enzyme and gallic acid in reaction systems， reaction time and gallic acid concentration. Results showed that the maximum inhibition rate （95.52%） of pancreatic α-amylase was achieved by pre warming the enzyme at a c oncentration of 0. 64 mg/mL in the presence of gallic acid at 37 ℃ for 5 min before addition of 1 g/100 mL starch and allowing the reaction to proceed for 15 min. Gallic acid exhibited the strongest inhibition on pancreatic trypsin （by 99.24%） by prewarming their mixture at 40 ℃ for 5 min followed by addition of 1 g/100 mL casein as the substrate and permitting the reaction to take place for 30 min. The inhibitory effect of gallic acid on both en zyme activities was positively associated with its concentration.

gallic acid； pancreatic α-amylase； pancreatic trypsin； inhibitory effect

TS201.2

A

1002-6630（2015）03-0041-05

10.7506/spkx1002-6630-201503008

2014-02-22

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD10B00；2012BAD33B11）

秦昱（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)椴杓爸参锕δ艹煞只瘜W(xué)。E-mail：qinyu199175@163.com

肖文軍（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锕δ艹煞掷?。E-mail：xiaowenjun88@sina.com