康學(xué)東，張瀚文，余臣祖

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

黃金膠囊對(duì)2型糖尿病伴胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞PI-3K、GLUT4蛋白表達(dá)的影響

康學(xué)東1，張瀚文2，余臣祖2

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

目的：觀察黃金膠囊對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4（GLUT4）表達(dá)的影響，探討其改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。方法：采用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射加高熱量飼料喂養(yǎng)，制備2型糖尿病（T2DM）伴胰島素抵抗（IR）大鼠模型，通過(guò)免疫組化法觀察黃金膠囊對(duì)糖尿病各組大鼠體重、血糖及骨骼肌細(xì)胞PI-3K和GLUT4蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：黃金膠囊組大鼠較模型組體重減輕，血糖降低，骨骼肌細(xì)胞PI-3K和GLUT4的蛋白表達(dá)提高，作用與羅格列酮組相當(dāng)。結(jié)論：黃金膠囊改善T2DM伴IR大鼠體重、降低血糖機(jī)制可能與提高骨骼肌細(xì)胞PI-3K和GLUT4的蛋白表達(dá)有關(guān)。

2型糖尿??；胰島素抵抗；黃金膠囊；羅格列酮

在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中胰島素抵抗作為重要的發(fā)病因素與其有著密切的聯(lián)系。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)研究中醫(yī)藥對(duì)胰島素抵抗的干預(yù)有了一定的進(jìn)展。其中尤以黃連的研究最多，其主要成分中小檗堿含量最高，研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的降血糖作用。同時(shí)雞內(nèi)金的有效成分雞內(nèi)金多糖也同樣具有降低血糖、血脂的作用。本課題的前期研究證明，黃金膠囊在大劑量治療2型糖尿病大鼠時(shí)具有明顯改善胰島素抵抗的作用，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究黃金膠囊改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 選用4月齡、雄性SPF級(jí)W istar大鼠60只，體重200～250 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（甘）2011-0001-0001365，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào)：SYXK（甘）2011-0001-0000407］。W istar大鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后，按體重編號(hào)，查隨機(jī)數(shù)字表抽取10只大鼠為空白組（喂以普通飼料）；其余50只為造模組，均喂以高脂飼料，高脂飼料參考Leng S等［1］稍作修改（其中含膽固醇2%，豬油10%，基礎(chǔ)飼料88%），造模組喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，將鏈脲佐菌素（STZ）溶于0.1mm ol/L檸檬酸緩沖液（pH=4.4）中，按劑量50 m g/kg一次性左下腹腔注射，72 h后禁食、不禁水12 h，尾靜脈采血，測(cè)量大鼠尾靜脈空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（OGTT2h），取FPG≥11.0 mm ol/L、OGTT2h≥16.7 mm ol/L的大鼠歸入糖尿病模型組。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、羅格列酮組、金膠囊組，各組動(dòng)物分別灌胃藥物或生理鹽水（NS），每天1次，給藥劑量按人與大鼠體表面積比折算成等效劑量?？瞻捉M、模型組分別每天灌胃等劑量的NS（1m L/kg）；羅格列酮組每天灌胃羅格列酮溶液（0.36m g/kg）；黃金膠囊組每天灌胃等體積黃金膠囊溶液（2.025 g/kg）。除空白組外，其余各組均繼續(xù)喂以高脂飼料10周，并每周稱(chēng)體重。

1.2 試劑與藥物 鏈脲佐菌素（STZ）［Sigm a公司（美國(guó)），產(chǎn)品批號(hào)：S0130-1G］；羅格列酮（太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：13010006，規(guī)格：4m g）；黃金膠囊（由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào)：1201101）；瑞特血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和試紙條［廠家：華廣生技股份有限公司，注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械（許）字2012第2400103號(hào)］；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：11CM 251），葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4（GLUT4）免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BA1353-1），一抗山羊抗兔免疫組化試劑盒（先北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：14188A05）。

1.3 檢測(cè)方法 喂養(yǎng)10周后尾靜脈取血，采用瑞特血糖監(jiān)測(cè)儀和試紙條測(cè)定血糖。取大鼠一側(cè)后肢骨骼肌，大小約2mm×15mm×10mm，放于實(shí)驗(yàn)前編號(hào)的廣口瓶中，加入4%多聚甲醛溶液固定，24 h后送病理實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)石蠟包埋、切片（5μm），行免疫組化染色，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析

系統(tǒng)分析圖像，測(cè)定PI3K，GLUT4平均光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及配對(duì)T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化比較 見(jiàn)表1。模型組給藥后體重與黃金膠囊組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體重變化比較（±s） g

表1 各組大鼠體重變化比較（±s） g

與模型組相比較，①P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊組樣本數(shù)12 12 12 12給藥前247.7±22.83 253.5±25.50 248.6±19.85 250.7±24.53給藥后320.8±18.12 418.9±18.90 368.1±17.29 289.8±15.55①

2.2 各組大鼠FPG變化比較 見(jiàn)表2。大鼠經(jīng)造模后空白組與其余各組FPG比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，模型組FPG與其他用藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各藥物組均治療有效。

表2 各組大鼠FPG變化比較（±s） mmol/L

表2 各組大鼠FPG變化比較（±s） mmol/L

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊組樣本數(shù)12 12 12 12劑量（mg/kg）等體積NS等體積NS 0.5 20.25給藥前4.52±0.48 21.54±2.88①22.45±3.67①22.68±3.42①給藥后4.48±0.51 26.47±1.23 12.67±0.87②13.36±1.01②

2.3 各組大鼠OGTT2h變化比較 見(jiàn)表3。大鼠經(jīng)造模后空白組與其余各組OGTT2h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，模型組OGTT2h與其他用藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各藥物組均治療有效。

表3 各組大鼠OGTT2h變化比較（±s） mmol/L

表3 各組大鼠OGTT2h變化比較（±s） mmol/L

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊組樣本數(shù)12 12 12 12劑量（mg/kg）等體積NS等體積NS 0.5 20.25用藥前4.63±0.46 21.54±2.88①22.45±3.67①22.68±3.42①用藥后6.94±0.62 25.98±3.25 12.85±0.67②16.51±1.09②

2.4 各組大鼠骨骼肌組織PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4、表5、圖1、圖2。免疫組化染色后的空白組正常骨骼肌組織中棕色區(qū)域提示PI3K陽(yáng)性，棕色染色均勻分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，表達(dá)蛋白染色呈深棕色，呈點(diǎn)狀，細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性染色不明顯。模型組中目標(biāo)蛋白主要分布在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性染色顆粒數(shù)量減少，分布不均勻，顏色呈淺黃色，說(shuō)明目標(biāo)蛋白表達(dá)明顯減弱，相同視野內(nèi)陽(yáng)性顯色面積較正常骨骼肌組織明顯減少。羅格列酮組陽(yáng)性表達(dá)位置不變，相同視野內(nèi)陽(yáng)性顯色細(xì)胞分布不均勻，陽(yáng)性表達(dá)較低于空白組，高于模型組。黃金膠囊組陽(yáng)性表達(dá)特點(diǎn)同羅格列酮組，但陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量及表達(dá)強(qiáng)度低于羅格列酮組，高于模型組。通過(guò)切片圖像學(xué)分析：空白組PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)與其他各組比較，蛋白表達(dá)最強(qiáng)最明顯（P＜0.05），模型則呈現(xiàn)低表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度低于羅格列酮組及黃金膠囊組（P＜0.05），羅格列酮組與黃金膠囊組比較，前者表達(dá)強(qiáng)度更強(qiáng)（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠PI3K蛋白免疫組化圖（空白組為A，模型組為B，羅格列酮組為C，黃金膠囊組為D）

圖2 各組大鼠GLUT4蛋白免疫組化圖（空白組為A，模型組為B，羅格列酮組為C，黃金膠囊組為D）

表4 各組大鼠骨骼肌組織PI3K蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠骨骼肌組織PI3K蛋白表達(dá)比較（±s）

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與羅格列酮組比較，③P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊組樣本數(shù)12 12 12 12平均光密度0.381±0.012 0.310±0.008①0.370±0.041①②0.353±0.006①②③

表5 各組大鼠骨骼肌組織GLUT4蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠骨骼肌組織GLUT4蛋白表達(dá)比較（±s）

與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與羅格列酮組比較，③P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊組樣本數(shù)12 12 12 12平均光密度0.378±0.009 0.309±0.007①0.364±0.006①②0.351±0.010①②③

3 討論

向雪松［2］比較了不同實(shí)驗(yàn)所用的高脂飼料的構(gòu)成，指出動(dòng)物飼料組成豬油占10%、蔗糖占20%這樣的配比，易于誘發(fā)胰島素抵抗、造模成功率較高且能使血糖中度升高，是較好的復(fù)制2型糖尿病模型的高脂飼料的選擇。本研究采用的高脂飼料配比方案來(lái)自于模擬2型糖尿病患者的飲食模式進(jìn)行的高脂飼料的成分配比，其中膽固醇及膽酸鹽的添加，無(wú)疑是本研究的亮點(diǎn)所在。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胰島素通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)糖代謝和能量代謝。其中PI3K途徑被認(rèn)為是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典途徑［3］，PI3K途徑是胰島素在靶器官中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路之一，胰島素作用的靶器官，在攝取利用葡萄糖時(shí)，是經(jīng)由一步一步蛋白結(jié)合，信號(hào)激活所傳導(dǎo)下去的。即從胰島素受體到胰島素受體底物-1，再到PI3K最后傳遞至GLUT4等一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程完成的［4］。這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的任何環(huán)節(jié)障礙均可引起胰島素抵抗。

目前，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，黃連及其有效成分生物堿對(duì)于改善糖尿病及其并發(fā)癥的各種癥狀具有明顯效果，但其作用機(jī)制尚未完全闡明?，F(xiàn)今對(duì)黃連的研究表明，黃連中的主要成分為小檗堿，研究表明小檗堿可以改善胰島素抵抗、刺激胰島素分泌，及降低血脂［5］。小檗堿可以增加肝臟中過(guò)氧化物酶增殖體激活受體，同時(shí)可上調(diào)肝臟胰島素誘導(dǎo)基因［6］。有研究表明，黃連中所含的生物堿可提高大鼠骨骼肌糖原儲(chǔ)存，增加糖尿病大鼠胰島素底物、GLUT4，從而起到降低血糖的作用［7］。現(xiàn)代對(duì)雞內(nèi)金的研究表明，雞內(nèi)金內(nèi)含有雞內(nèi)金多糖，其可提高糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，改善其細(xì)胞免疫功能，依據(jù)對(duì)給予雞內(nèi)金多糖大鼠的跟蹤研究表明，雞內(nèi)金多糖可降低空腹血糖水平，同時(shí)對(duì)血脂有一定的調(diào)節(jié)作用。在黃金膠囊改善2型糖尿病胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性研究中，黃金膠囊可以提高胰島素敏感指數(shù)［8］。

2型糖尿病多系特異性體質(zhì)人群長(zhǎng)期飲食失常（如過(guò)食肥甘厚味等）與體力活動(dòng)減少等共同作用致使人體氣化失常、濁毒積聚，進(jìn)而阻礙氣血運(yùn)行，影響臟腑功能所致，中醫(yī)治療2型糖尿病伴胰島素抵抗從毒濁論治，解毒化濁、調(diào)氣活血。本實(shí)驗(yàn)所用的黃金膠囊，藥物組成為黃連、雞內(nèi)金。黃連苦寒，清熱燥濕，瀉火解毒。長(zhǎng)期應(yīng)用損傷脾胃，故佐以雞內(nèi)金運(yùn)脾消食，護(hù)胃和中，二藥合用，共奏解毒化濁、調(diào)氣活血之效。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，黃金膠囊可降低血糖、體重，增加骨骼肌細(xì)胞PI3K和GLUT4蛋白表達(dá)，效應(yīng)基本與羅格列酮一致，推測(cè)黃金膠囊提高胰島素敏感性的作用，與激活骨骼肌組織胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中PI3K和GLUT4的蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R587.1

A

0256-7415（2015）12-0227-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.12.102

2015-03-30

甘肅省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（1208RJZA179）；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年科研基金項(xiàng)目（ZQ2014-12）

康學(xué)東（1962-），男，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病及其并發(fā)癥。

余臣祖，E-mail：442940743@qq.com。