周大為

杭州市中醫(yī)院病理科，浙江 杭州 310007

槐耳顆粒對乳腺癌動物模型Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)的影響

周大為

杭州市中醫(yī)院病理科，浙江 杭州 310007

目的：探討槐耳顆粒對乳腺癌動物模型Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)的影響。方法：通過接種MCF-7、ER+/PR+乳腺癌細(xì)胞系構(gòu)建乳腺癌裸鼠模型40只，隨機(jī)分為空白對照組（安慰劑，10只）、槐耳顆粒組（30只），腫瘤0.5～1.0 cm后開始給藥，均干預(yù)21天，用藥期間間隔2天測量腫瘤體積1次。處死裸鼠通過免疫組化方法測定Ki67、p53、CerbB-2等蛋白表達(dá)。結(jié)果：槐耳顆粒組給藥7天、14天、21天PR、Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：槐耳顆粒能明顯降低Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)，對乳腺癌腫瘤生長有一定的抑制作用。

乳腺癌；槐耳顆粒；動物模型；蛋白表達(dá)

研究證明，Ki67、p53、CerbB-2蛋白參與腫瘤生長、增殖、分化、轉(zhuǎn)移，為此可將上述蛋白表達(dá)作為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展評估的重要指標(biāo)［1］?；倍w粒從槐耳菌質(zhì)中提取，不僅可直接抗腫瘤，而且能增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。目前，臨床關(guān)于Ki67等蛋白在惡性腫瘤中表達(dá)、槐耳顆粒治療乳腺癌效果研究較多，但關(guān)于槐耳顆粒對乳腺癌Ki67、p53、CerbB-2等蛋白表達(dá)影響研究甚少?；诖耍狙芯客ㄟ^動物模型對照實驗分析槐耳顆粒對Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)的影響，以為槐耳

顆粒治療乳腺癌提供依據(jù)，結(jié)果報道如下。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物及細(xì)胞株 取40只健康雌性裸鼠（中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供），日齡20～28天，平均（25.5±1.5）天；體重10～15 g，平均（12.5±1.0）g。雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞（上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司提供）。

1.2 藥物及試劑 鼠抗人一抗、二抗由北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司提供；p53、Ki-67、CerbB-2等蛋白免疫組化檢測試劑盒；槐耳顆粒由啟東蓋天力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供。

2 方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng) MCF-7、ER+、PR+細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境：10% FCS-RPM I-1640培養(yǎng)液，溫度維持37℃，二氧化碳濃度5%，濕度處于飽和狀態(tài)。

2.2 動物模型建立 ①40只雌性裸鼠SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，弱酸飲用水消毒滅菌后使用，單獨分籠喂養(yǎng)，每天紫外線照射4 h，同時不限制自然光照射。保持裸鼠生活溫度23～28℃，濕度40%～60%，飲用水2天更換1次，墊料7天更換1次。②培養(yǎng)細(xì)胞處理。生長期細(xì)胞胰酶消化停止后4℃環(huán)境下離心，轉(zhuǎn)速1000 r/m in，8m in左右，去上清后RPM I-1640培養(yǎng)液離心，溫度、轉(zhuǎn)速、時間同上，洗滌2次后于一定量PBS中重新懸浮，保持細(xì)胞密度5×105～5×106/m L，冰盒中保存?zhèn)溆谩＂勐闶笪桂B(yǎng)7天后隨機(jī)分組行MCF-7、ER+/PR+細(xì)胞接種，完成后繼續(xù)喂養(yǎng)一段時間，這個過程中密切觀察裸鼠飲食、排便、精神等情況。10天后裸鼠體內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)開始形成，腫瘤形成率100%，均納入實驗。

2.3 實驗動物分組 隨機(jī)分為2組：空白對照組（安慰劑）10只，槐耳顆粒組30只，腫瘤直徑0.5～1.0 cm后開始給藥，20 g槐耳顆粒（主要成分為槐耳菌質(zhì)）灌胃，根據(jù)裸鼠體重變化適當(dāng)調(diào)整用藥劑量。用藥期間對飲食、飲水不限制，同時加強(qiáng)營養(yǎng)，飲用水、墊料每天更換。定期測定觀察裸鼠腫塊體積情況。用藥21天后處死裸鼠，將瘤塊快速取出，甲醛中固定，行免疫組化測定。

3 觀察指標(biāo)與統(tǒng)計學(xué)方法

3.1 觀察指標(biāo) 觀察記錄裸鼠應(yīng)用槐耳顆粒后不同時間點ER、PR、Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)情況，根據(jù)著色程度、陽性細(xì)胞比例評價免疫組化結(jié)果，著色程度分為0分、1分、2分、3分，分別對應(yīng)無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色；陽性細(xì)胞比例為＜10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，對應(yīng)0分、1分、2分、3分、4分，兩種評分相乘判斷：陰性-0分（-），弱陽性-1～4分（+），中度陽性-5～8分（++）、強(qiáng)陽性-9～12分（+++或++++）。

3.2 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。

4 結(jié)果

4.1 槐耳顆粒干預(yù)前后免疫組化指標(biāo)變化 見表1。槐耳顆粒組用藥不同時間點ER表達(dá)與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；倍w粒組用藥不同時間點PR、Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)較空白對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 槐耳顆粒干預(yù)前后免疫組化指標(biāo)比較

4.2 槐耳顆粒干預(yù)后瘤體病理變化情況 見圖1～3?；倍w粒干預(yù)7天、14天、21天瘤體中心變化情況。

圖1 干預(yù)7天情況

圖2 干預(yù)14天情況

圖3 干預(yù)21天情況

5 討論

有調(diào)查顯示，我國2003—2009年城市乳腺癌病死率增加約39%，是導(dǎo)致女性死亡的高危因素之一。目前，臨床治療乳腺癌方法較多，包括手術(shù)、放化療、中醫(yī)藥等，但整體上來說乳腺癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，尤其是術(shù)后2年，遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移占早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的50%～70%［2］，預(yù)后差。為此選擇一種有效方案降低乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率至關(guān)重要。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺癌屬乳癖、乳巖等范疇，與肝、脾、胃密切相關(guān)，較多醫(yī)書中提到乳腺癌發(fā)生其內(nèi)因在于正氣不足，其外因與外邪入侵、情志不舒致使氣血瘀滯、脾胃失和有關(guān)。相關(guān)報道稱，中醫(yī)藥可能是通過對癌細(xì)胞生長抑制、阻止誘變物和靶分子結(jié)合等對乳腺癌作用［3］。槐耳顆粒主要成分為槐耳菌質(zhì)（成分單一），槐耳味苦，辛且平，歸肝、脾經(jīng)，具有止血、抗癌功效。動物實驗表明，槐耳成分中藥能明顯延長腫瘤小鼠生命期限，抗腫瘤作用較強(qiáng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槐耳能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，提高機(jī)體免疫能力，同時槐耳對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移有一定的影響，通過提高溶菌酶活性、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能等以抑制腫瘤細(xì)胞株生長［4］。關(guān)若丹等［5］通過對照實驗表明槐耳顆粒在延長早期乳腺癌患者生存期、降低

其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率有一定的優(yōu)勢。關(guān)于槐耳顆粒與乳腺癌研究著重于觀察患者復(fù)發(fā)率及生存時間，而關(guān)于槐耳顆粒對乳腺癌腫瘤生長抑制作用機(jī)制研究相對少。近年來腫瘤標(biāo)志物、相關(guān)蛋白表達(dá)在腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后評估中起重要作用，如p53、Ki67、CerbB-2等，其中p53為抗癌基因，野生型P53基因?qū)Π┘?xì)胞生長、分裂及其他癌基因活性有抑制作用。Ki67屬于一種抗原，于增殖細(xì)胞核基質(zhì)中存在，對腫瘤細(xì)胞增殖活性直接反映，且敏感性高，同時可有效反映增殖細(xì)胞數(shù)目，臨床常用于腫瘤細(xì)胞增殖速度測定［6］。CerbB-2是存在于17q21區(qū)帶上的一種酪氨酸蛋白，密切參與細(xì)胞生長，對細(xì)胞增殖、分化可有效反映［7～8］。為此通過實驗分析槐耳顆粒對乳腺癌細(xì)胞p53、Ki67、CerbB-2等蛋白表達(dá)的影響，了解槐耳顆粒作用機(jī)制，對乳腺癌診治、預(yù)后評估有十分重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，槐耳顆粒組用藥后不同時間點Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)較空白對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示槐耳顆粒對Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，具體來說，上述蛋白能抑制乳腺癌細(xì)胞生長、增殖，且有時間依賴性。臨床常認(rèn)為，藥物抗腫瘤作用發(fā)育與抗孕激素密切相關(guān)，如米非司酮，本研究結(jié)果顯示，槐耳顆粒組用藥后不同時間點PR較空白對照組降低（P＜0.05），這可能與槐耳顆粒對孕激素受體陽性敏感性更高有關(guān)，因此用藥期間陽性細(xì)胞被殺傷，用藥后PR陽性率下降。

綜上所述，槐耳顆?？娠@著降低乳腺癌裸鼠模型Ki67、p53、CerbB-2蛋白表達(dá)，抑制乳腺癌腫瘤生長、增殖，這可能是槐耳顆粒對乳腺癌發(fā)揮療效的作用機(jī)制，臨床值得進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：劉淑婷）

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0256-7415（2015）12-0224-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.12.101

2015-08-12

周大為（1973-），男，主管技師，研究方向：病理學(xué)。