周亞菁， 查日維， 謝曉梅， 張 靜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊，安徽　合肥　230012）

宣木瓜總有機酸的提取和純化工藝優(yōu)化

周亞菁， 查日維， 謝曉梅*， 張 靜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊，安徽合肥230012）

目的 建立提取、純化宣木瓜總有機酸的最佳工藝。方法 以可滴定總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，運用正交試驗優(yōu)化宣木瓜總有機酸提取工藝；通過單因素試驗，考察上樣溶液質(zhì)量濃度、pH、HCl洗脫液濃度和體積流量對強堿型陰離子交換樹脂純化總有機酸的影響。結(jié)果 最佳提取工藝是料液比1∶8，75%乙醇，提取時間2 h，提取次數(shù)2次；最佳純化工藝是上樣溶液質(zhì)量濃度1 g/mL，樣品液pH為10，HCl洗脫液濃度為0.3 mol/L，體積流量為3 mL/min。此工藝下所得宣木瓜總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)67.66%。結(jié)論 本方法可有效提取、純化宣木瓜總有機酸，工藝穩(wěn)定、可行，易于實施，。

宣木瓜；總有機酸；回流提取；陰離子交換

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實，宣木瓜是藥用木瓜的道地藥材［1］。木瓜藥材的傳統(tǒng)評價是“味酸者為佳”［2］，《中國藥典》規(guī)定木瓜水提液的pH應(yīng)在3.0～4.0［3］，可見酸性是構(gòu)成木瓜藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。中藥有機酸藥理作用廣泛［4］，已有研究表明總有機酸是宣木瓜鎮(zhèn)痛抗炎作用的有效組分之一［5］。木瓜有機酸組成復(fù)雜，既有極性強的水溶性有機酸（如蘋果酸、檸檬酸等［6］），也有極性弱的水不溶性有機酸（如齊墩果酸、熊果酸等三萜酸［7］），還有極性介于其間的酚酸（如綠原酸、咖啡酸等［8］）。關(guān)于宣木瓜有機酸提取純化工藝鮮見研究報道。鑒于木瓜有機酸極性分布寬的特點，本實驗采用含水乙醇提取制備宣木瓜總有機酸粗提物，再利用717型強堿型陰離子交換樹脂純化總有機酸；以可滴定總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，建立提取、純化宣木瓜總有機酸的最佳工藝，旨在為宣木瓜總有機酸制備及開發(fā)利用提供實驗資料和科學(xué)依據(jù)。

1　儀器和材料

宣木瓜藥材收集于安徽宣城（2012年10月），經(jīng)安徽省宣州市金泉生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司姚勇高級工程師鑒定為貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的近成熟果實，粉碎（過40目篩）備用。717型強堿性陰離子交換樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），所用試劑均為分析純，水為超純水。

BP211D電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；pHS-3CA精密酸度計（上海大普儀器有限公司）；MiLLi-QAdvantage超純水機（美國MiLLipore公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；80-2B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2　方法和結(jié)果

2.1總有機酸的測定 采用電位滴定法測定總有機酸。取宣木瓜藥材提取或純化樣品適量，加水溶解、定容，精取15mL，按電位滴定法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅧA），用已標(biāo)定的0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用Origin 6.0 Professional繪制滴定曲線（見圖1），二級微商內(nèi)插法確定滴定終點，以蘋果酸（C4H6O5）計算總有機酸含有量。

2.2總有機酸提取工藝優(yōu)化 在前期提取方法比較試驗的基礎(chǔ)上，選用回流提取法［9］。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）4個因素進(jìn)行考察，各因素均確定為三個水平，依據(jù)L9（34）正交試驗法，以總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，確立最佳提取工藝。提取操作為：精密稱取宣木瓜樣品10 g置圓底燒瓶中，加適量溶劑回流提取，濾過，濾液濃縮，真空干燥，得總有機酸提取物；取提取物適量，按“2.1”項下測定總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因素水平見表1，正交試驗方案和結(jié)果、方差分析見表2、表3。

表3表明F值均小于F臨界值，即各因素對提取的影響無顯著性差異，所以采用直觀分析。表2中極差（R）結(jié)果表明，料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）4個因素對宣木瓜總有機酸提取含有量的影響為：D＞C＞B＞A，總有機酸提取的最佳工藝組合為A1B2C2D2，即料液比1∶8，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時間2h，提取次數(shù)2次。

圖1　總有機酸提取純化產(chǎn)品的滴定曲線（A）和二級微商曲線（B）

2.3總有機酸提取工藝驗證 稱取宣木瓜藥材150 g，按“2.2”項下的提取操作及優(yōu)選工藝參數(shù)，平行操作3份，提取物按“2.1”項下方法測定，可滴定總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33.20%，34.08%，33.47%，結(jié)果表明總有機酸提取工藝穩(wěn)定、可行。

表1　因素水平

表2　宣木瓜總有機酸提取正交試驗結(jié)果

表3　方差分析

2.4總有機酸純化工藝優(yōu)化

2.4.1樹脂的預(yù)處理 參照文獻(xiàn)［10］，取717型強堿型陰離子交換樹脂適量，置3 000 mL燒杯中，用水洗至水相澄清，水浸泡24 h使其充分膨脹，傾去水層；用樹脂體積2倍量的1 mol/LNaOH溶液浸泡4 h；再用水洗至中性；然后用1 mol/L HCl溶液浸泡4 h，再用水洗至中性，最后再用1 mol/L NaOH溶液浸泡8 h，水洗至中性，備用。

2.4.2上樣溶液的制備 取“2.2”項下優(yōu)化工藝所得提取物適量，加水溶解分散，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH，靜置一夜，超聲30 min，離心30 min（2 000 r/min），取上清液濃縮制得上樣溶液，備用。

2.4.3吸附泄漏試驗 將預(yù)處理好的樹脂裝入層析柱中（2 cm×10 cm），柱床體積為10 mL，精密量取“2.4.2”項下上樣溶液50 mL，控制體積流量1.0 mL/min通過層析柱，每5 m L為1管，以流出液pH為縱坐標(biāo)，洗脫液體積為橫坐標(biāo)，繪制吸附泄漏曲線［11］。吸附泄漏曲線見圖2。當(dāng)收集到第5管時，溶液pH與原上樣溶液接近，說明此時樹脂柱達(dá)到吸附飽和，即當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL時，717型陰離子交換樹脂對宣木瓜總有機酸吸附的泄露點為2.5 BV左右，此時樹脂吸附達(dá)到最佳。

圖2　717型陰離子交換樹脂吸附總有機酸的泄漏曲線

2.4.4上樣液質(zhì)量濃度的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 g/mL的上樣溶液，取10 mL經(jīng)處理過的樹脂，濕法裝柱，上樣體積流量為1 mL/min，吸附飽和后用去離子水沖洗，鹽酸洗脫，收集洗脫液，水飽和正丁醇等體積萃取，直至正丁醇層無有機酸反應(yīng)，合并萃取相，減壓濃縮、干燥，即得純化的總有機酸。按“2.1”項下方法測定總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

2.4.5洗脫劑濃度的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的上樣液依法上樣、水洗，再分別以0.3、0.5、1.0 mol/L的HCl洗脫，收集洗脫液，按“2.4.4”項下方法萃取、測定，結(jié)果見表4。

2.4.6洗脫體積流量的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的上樣液依法上樣、水洗，再分別用鹽酸以0.5、1.0、3.0 mL/min的體積流量洗脫，收集洗脫液，按“2.4.4”項下方法萃取、測定，結(jié)果見表4。

2.4.7上樣液pH的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL pH為9、10、11的上樣液依法上樣、水洗，洗脫，收集洗脫液，按“2.4.4”項下方法萃取、測定，結(jié)果見表4。

表4　宣木瓜有機酸純化工藝影響因素的考察結(jié)果

由表4可知，宣木瓜總有機酸的最佳純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL、上樣液pH為10、HCl洗脫劑濃度0.3 mol/L、洗脫體積流量為3 mL/min。

2.5總有機酸純化工藝驗證 稱取宣木瓜醇提物2.6 g，按“2.4”項下的純化操作及優(yōu)選工藝參數(shù)，平行操作3份，純化物按“2.1”項下方法測定，可滴定總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為69.79%、66.53%、66.66%，表明717型陰離子交換樹脂純化宣木瓜總有機酸工藝穩(wěn)定、可行。

3　討論

3.1宣木瓜所含有機酸種類豐富，pKa值多在3～5左右，滴定曲線表現(xiàn)出明顯的滴定突躍；因為樣品溶液顏色會干擾指示劑的終點判斷，故采用了電位滴定法。

3.2本實驗通過對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取次數(shù)的正交試驗，優(yōu)選出總有機酸提取工藝，通過測定原料總有機酸，表明提取物總有機酸轉(zhuǎn)移率可達(dá)75%以上。

3.3在離子交換樹脂純化有機酸的實驗中，考察了上樣液質(zhì)量濃度、洗脫劑濃度、洗脫體積流量及上樣液pH對宣木瓜總有機酸動態(tài)吸附的影響，發(fā)現(xiàn)上樣液pH對純化物總有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大影響，提高pH有利于有機酸解離，便于與樹脂的陰離子發(fā)生交換，從而得到高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。選擇HCl作為洗脫劑，不僅有利于酸性AgNO3試液判斷洗脫終點［12］，而且在酸性條件下，結(jié)合在離子交換樹脂上的有機酸根離子會轉(zhuǎn)化為游離有機酸，利于洗脫。經(jīng)過離子交換工藝后，宣木瓜中總有機酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由提取物中的33.58%提高到67.66%，取得了較好的純化富集效果。

3.4本實驗還考察了醇提物堿化除雜、酸化后有機溶劑萃取宣木瓜總有機酸，所得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于上述結(jié)果；故選用本法提取純化宣木瓜中總有機酸有效可行，且易于實施。

［1］ 彭華勝，程銘恩，王德群，等.藥用木瓜的資源與采收加工調(diào)查［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（10）：1296-1298.

［2］ 黃立厚，王尚全，朱永芳.宣木瓜采收期的選擇［J］.中藥材，1986（5）：1-2.

［3］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：57.

［4］ 湯喜蘭，劉建勛，李 磊.中藥有機酸類成分的藥理作用及在心血管疾病中的應(yīng)用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：243-246.

［5］ 李 娜，金敬紅，姜洪芳，等.宣木瓜總有機酸的純化及鎮(zhèn)痛抗炎作用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：113-119.

［6］ 謝海偉，張 斌，楊賢松，等.宣木瓜有效成分的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2012，35（1）：157-161.

［7］ 張 玲，謝曉梅，彭華勝，等.不同產(chǎn)地木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的比較研究［J］.中藥材，2009，32（5）：673-676.

［8］ 陶君彥，熊富良，張瓊光，等.木瓜藥材中綠原酸、咖啡酸提取工藝研究［J］.中成藥，2007，29（6）：904-906.

［9］ 査日維，謝曉梅，楊 沫，等.基于AHP的多指標(biāo)綜合評價優(yōu)選宣木瓜提取方法［J］.中成藥，2014，36（3）：643-646.

［10］ 馬廉舉，劉 新，卓玉娟，等.717陰離子交換樹脂吸附分離莽草酸的研究［J］.中藥材，2008，31（7）：1065-1067.

［11］ 陳 英，劉成國.離子交換樹脂對馬尾松松針中莽草酸的分離純化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（5）：119-123.

［12］ 陳劍鋒，陳 浩.一種采用強堿性陰離子交換樹脂提取扁桃酸的方法：中國，1948262A［P］.2006-11-01.

R284.2

B

1001-1528（2015）03-0664-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.047

2014-05-10

十二五國家科技支撐計劃（2011BAI04B06）；安徽高校省級自然科學(xué)研究項目（KJ2012A188）

周亞菁（1990—），女，碩士生，研究方向為中藥質(zhì)量分析。Tel：（0551）68129153，E-mail：513729364@qq.com

謝曉梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：（0551）68129153，E-mail：xiexiaomei9401@sina.com