周亞菁， 查日維， 謝曉梅， 張 靜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽　合肥　230012）

宣木瓜總有機(jī)酸的提取和純化工藝優(yōu)化

周亞菁， 查日維， 謝曉梅*， 張 靜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開(kāi)發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽合肥230012）

目的 建立提取、純化宣木瓜總有機(jī)酸的最佳工藝。方法 以可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化宣木瓜總有機(jī)酸提取工藝；通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察上樣溶液質(zhì)量濃度、pH、HCl洗脫液濃度和體積流量對(duì)強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂純化總有機(jī)酸的影響。結(jié)果 最佳提取工藝是料液比1∶8，75%乙醇，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次；最佳純化工藝是上樣溶液質(zhì)量濃度1 g/mL，樣品液pH為10，HCl洗脫液濃度為0.3 mol/L，體積流量為3 mL/min。此工藝下所得宣木瓜總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)67.66%。結(jié)論 本方法可有效提取、純化宣木瓜總有機(jī)酸，工藝穩(wěn)定、可行，易于實(shí)施，。

宣木瓜；總有機(jī)酸；回流提??；陰離子交換

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實(shí)，宣木瓜是藥用木瓜的道地藥材［1］。木瓜藥材的傳統(tǒng)評(píng)價(jià)是“味酸者為佳”［2］，《中國(guó)藥典》規(guī)定木瓜水提液的pH應(yīng)在3.0～4.0［3］，可見(jiàn)酸性是構(gòu)成木瓜藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。中藥有機(jī)酸藥理作用廣泛［4］，已有研究表明總有機(jī)酸是宣木瓜鎮(zhèn)痛抗炎作用的有效組分之一［5］。木瓜有機(jī)酸組成復(fù)雜，既有極性強(qiáng)的水溶性有機(jī)酸（如蘋(píng)果酸、檸檬酸等［6］），也有極性弱的水不溶性有機(jī)酸（如齊墩果酸、熊果酸等三萜酸［7］），還有極性介于其間的酚酸（如綠原酸、咖啡酸等［8］）。關(guān)于宣木瓜有機(jī)酸提取純化工藝鮮見(jiàn)研究報(bào)道。鑒于木瓜有機(jī)酸極性分布寬的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用含水乙醇提取制備宣木瓜總有機(jī)酸粗提物，再利用717型強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂純化總有機(jī)酸；以可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，建立提取、純化宣木瓜總有機(jī)酸的最佳工藝，旨在為宣木瓜總有機(jī)酸制備及開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)資料和科學(xué)依據(jù)。

1　儀器和材料

宣木瓜藥材收集于安徽宣城（2012年10月），經(jīng)安徽省宣州市金泉生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司姚勇高級(jí)工程師鑒定為貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的近成熟果實(shí)，粉碎（過(guò)40目篩）備用。717型強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），所用試劑均為分析純，水為超純水。

BP211D電子天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司）；pHS-3CA精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；MiLLi-QAdvantage超純水機(jī)（美國(guó)MiLLipore公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；80-2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2　方法和結(jié)果

2.1總有機(jī)酸的測(cè)定 采用電位滴定法測(cè)定總有機(jī)酸。取宣木瓜藥材提取或純化樣品適量，加水溶解、定容，精取15mL，按電位滴定法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅧA），用已標(biāo)定的0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用Origin 6.0 Professional繪制滴定曲線（見(jiàn)圖1），二級(jí)微商內(nèi)插法確定滴定終點(diǎn)，以蘋(píng)果酸（C4H6O5）計(jì)算總有機(jī)酸含有量。

2.2總有機(jī)酸提取工藝優(yōu)化 在前期提取方法比較試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用回流提取法［9］。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）4個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素均確定為三個(gè)水平，依據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)法，以總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，確立最佳提取工藝。提取操作為：精密稱取宣木瓜樣品10 g置圓底燒瓶中，加適量溶劑回流提取，濾過(guò)，濾液濃縮，真空干燥，得總有機(jī)酸提取物；取提取物適量，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)方案和結(jié)果、方差分析見(jiàn)表2、表3。

表3表明F值均小于F臨界值，即各因素對(duì)提取的影響無(wú)顯著性差異，所以采用直觀分析。表2中極差（R）結(jié)果表明，料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）4個(gè)因素對(duì)宣木瓜總有機(jī)酸提取含有量的影響為：D＞C＞B＞A，總有機(jī)酸提取的最佳工藝組合為A1B2C2D2，即料液比1∶8，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)2次。

圖1　總有機(jī)酸提取純化產(chǎn)品的滴定曲線（A）和二級(jí)微商曲線（B）

2.3總有機(jī)酸提取工藝驗(yàn)證 稱取宣木瓜藥材150 g，按“2.2”項(xiàng)下的提取操作及優(yōu)選工藝參數(shù)，平行操作3份，提取物按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33.20%，34.08%，33.47%，結(jié)果表明總有機(jī)酸提取工藝穩(wěn)定、可行。

表1　因素水平

表2　宣木瓜總有機(jī)酸提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析

2.4總有機(jī)酸純化工藝優(yōu)化

2.4.1樹(shù)脂的預(yù)處理 參照文獻(xiàn)［10］，取717型強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂適量，置3 000 mL燒杯中，用水洗至水相澄清，水浸泡24 h使其充分膨脹，傾去水層；用樹(shù)脂體積2倍量的1 mol/LNaOH溶液浸泡4 h；再用水洗至中性；然后用1 mol/L HCl溶液浸泡4 h，再用水洗至中性，最后再用1 mol/L NaOH溶液浸泡8 h，水洗至中性，備用。

2.4.2上樣溶液的制備 取“2.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝所得提取物適量，加水溶解分散，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH，靜置一夜，超聲30 min，離心30 min（2 000 r/min），取上清液濃縮制得上樣溶液，備用。

2.4.3吸附泄漏試驗(yàn) 將預(yù)處理好的樹(shù)脂裝入層析柱中（2 cm×10 cm），柱床體積為10 mL，精密量取“2.4.2”項(xiàng)下上樣溶液50 mL，控制體積流量1.0 mL/min通過(guò)層析柱，每5 m L為1管，以流出液pH為縱坐標(biāo)，洗脫液體積為橫坐標(biāo)，繪制吸附泄漏曲線［11］。吸附泄漏曲線見(jiàn)圖2。當(dāng)收集到第5管時(shí)，溶液pH與原上樣溶液接近，說(shuō)明此時(shí)樹(shù)脂柱達(dá)到吸附飽和，即當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL時(shí)，717型陰離子交換樹(shù)脂對(duì)宣木瓜總有機(jī)酸吸附的泄露點(diǎn)為2.5 BV左右，此時(shí)樹(shù)脂吸附達(dá)到最佳。

圖2　717型陰離子交換樹(shù)脂吸附總有機(jī)酸的泄漏曲線

2.4.4上樣液質(zhì)量濃度的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 g/mL的上樣溶液，取10 mL經(jīng)處理過(guò)的樹(shù)脂，濕法裝柱，上樣體積流量為1 mL/min，吸附飽和后用去離子水沖洗，鹽酸洗脫，收集洗脫液，水飽和正丁醇等體積萃取，直至正丁醇層無(wú)有機(jī)酸反應(yīng)，合并萃取相，減壓濃縮、干燥，即得純化的總有機(jī)酸。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.5洗脫劑濃度的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的上樣液依法上樣、水洗，再分別以0.3、0.5、1.0 mol/L的HCl洗脫，收集洗脫液，按“2.4.4”項(xiàng)下方法萃取、測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.6洗脫體積流量的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的上樣液依法上樣、水洗，再分別用鹽酸以0.5、1.0、3.0 mL/min的體積流量洗脫，收集洗脫液，按“2.4.4”項(xiàng)下方法萃取、測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.7上樣液pH的考察 量取10 mL上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL pH為9、10、11的上樣液依法上樣、水洗，洗脫，收集洗脫液，按“2.4.4”項(xiàng)下方法萃取、測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　宣木瓜有機(jī)酸純化工藝影響因素的考察結(jié)果

由表4可知，宣木瓜總有機(jī)酸的最佳純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL、上樣液pH為10、HCl洗脫劑濃度0.3 mol/L、洗脫體積流量為3 mL/min。

2.5總有機(jī)酸純化工藝驗(yàn)證 稱取宣木瓜醇提物2.6 g，按“2.4”項(xiàng)下的純化操作及優(yōu)選工藝參數(shù)，平行操作3份，純化物按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，可滴定總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為69.79%、66.53%、66.66%，表明717型陰離子交換樹(shù)脂純化宣木瓜總有機(jī)酸工藝穩(wěn)定、可行。

3　討論

3.1宣木瓜所含有機(jī)酸種類豐富，pKa值多在3～5左右，滴定曲線表現(xiàn)出明顯的滴定突躍；因?yàn)闃悠啡芤侯伾珪?huì)干擾指示劑的終點(diǎn)判斷，故采用了電位滴定法。

3.2本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)的正交試驗(yàn)，優(yōu)選出總有機(jī)酸提取工藝，通過(guò)測(cè)定原料總有機(jī)酸，表明提取物總有機(jī)酸轉(zhuǎn)移率可達(dá)75%以上。

3.3在離子交換樹(shù)脂純化有機(jī)酸的實(shí)驗(yàn)中，考察了上樣液質(zhì)量濃度、洗脫劑濃度、洗脫體積流量及上樣液pH對(duì)宣木瓜總有機(jī)酸動(dòng)態(tài)吸附的影響，發(fā)現(xiàn)上樣液pH對(duì)純化物總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大影響，提高pH有利于有機(jī)酸解離，便于與樹(shù)脂的陰離子發(fā)生交換，從而得到高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。選擇HCl作為洗脫劑，不僅有利于酸性AgNO3試液判斷洗脫終點(diǎn)［12］，而且在酸性條件下，結(jié)合在離子交換樹(shù)脂上的有機(jī)酸根離子會(huì)轉(zhuǎn)化為游離有機(jī)酸，利于洗脫。經(jīng)過(guò)離子交換工藝后，宣木瓜中總有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由提取物中的33.58%提高到67.66%，取得了較好的純化富集效果。

3.4本實(shí)驗(yàn)還考察了醇提物堿化除雜、酸化后有機(jī)溶劑萃取宣木瓜總有機(jī)酸，所得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于上述結(jié)果；故選用本法提取純化宣木瓜中總有機(jī)酸有效可行，且易于實(shí)施。

［1］ 彭華勝，程銘恩，王德群，等.藥用木瓜的資源與采收加工調(diào)查［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（10）：1296-1298.

［2］ 黃立厚，王尚全，朱永芳.宣木瓜采收期的選擇［J］.中藥材，1986（5）：1-2.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：57.

［4］ 湯喜蘭，劉建勛，李 磊.中藥有機(jī)酸類成分的藥理作用及在心血管疾病中的應(yīng)用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：243-246.

［5］ 李 娜，金敬紅，姜洪芳，等.宣木瓜總有機(jī)酸的純化及鎮(zhèn)痛抗炎作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：113-119.

［6］ 謝海偉，張 斌，楊賢松，等.宣木瓜有效成分的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2012，35（1）：157-161.

［7］ 張 玲，謝曉梅，彭華勝，等.不同產(chǎn)地木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的比較研究［J］.中藥材，2009，32（5）：673-676.

［8］ 陶君彥，熊富良，張瓊光，等.木瓜藥材中綠原酸、咖啡酸提取工藝研究［J］.中成藥，2007，29（6）：904-906.

［9］ 査日維，謝曉梅，楊 沫，等.基于AHP的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)優(yōu)選宣木瓜提取方法［J］.中成藥，2014，36（3）：643-646.

［10］ 馬廉舉，劉 新，卓玉娟，等.717陰離子交換樹(shù)脂吸附分離莽草酸的研究［J］.中藥材，2008，31（7）：1065-1067.

［11］ 陳 英，劉成國(guó).離子交換樹(shù)脂對(duì)馬尾松松針中莽草酸的分離純化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（5）：119-123.

［12］ 陳劍鋒，陳 浩.一種采用強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂提取扁桃酸的方法：中國(guó)，1948262A［P］.2006-11-01.

R284.2

B

1001-1528（2015）03-0664-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.047

2014-05-10

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI04B06）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2012A188）

周亞菁（1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析。Tel：（0551）68129153，E-mail：513729364@qq.com

謝曉梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：（0551）68129153，E-mail：xiexiaomei9401@sina.com