陳舒貞?張思萍

摘 要：目的 對(duì)對(duì)蝦白斑病毒1197基因的表達(dá)和產(chǎn)物純化進(jìn)行研究。方法 對(duì)對(duì)蝦白斑病毒的早晚期基因1197基因的表達(dá)和產(chǎn)物純化進(jìn)行研究，構(gòu)建PGEX—3Xll97表達(dá)質(zhì)粒，以及在大腸桿菌DE3中表達(dá)PGEX—3Xll97，對(duì)表達(dá)物進(jìn)行純化。使用FPLC的方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性處理。結(jié)果 將對(duì)蝦白斑病毒1197基因與PGEX—3X載體進(jìn)行連接，并鑒定PCR和酶切。在大腸桿菌DE3中，PGEX—3Xll97得到了表達(dá)和產(chǎn)物純化的融合蛋白。結(jié)論 本研究對(duì)對(duì)蝦白斑病毒1197基因的表達(dá)和產(chǎn)物進(jìn)行了純化，得到了1197基因表達(dá)的融合蛋白。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)物純化;對(duì)蝦白斑病毒;1197基因

上個(gè)世紀(jì)末以來(lái)，我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦的死亡現(xiàn)象就時(shí)有發(fā)生，給對(duì)蝦養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的損失。在研究中發(fā)現(xiàn)，能夠在體外對(duì)對(duì)蝦白斑病毒的早晚期基因1197進(jìn)行切割。本文主要是對(duì)1197基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行純化，從而進(jìn)一步的研究1197基因表達(dá)產(chǎn)物的功能。

一、材料與方法

1. 材料

使用本實(shí)驗(yàn)室的對(duì)蝦白斑病毒1197基因，在E61質(zhì)粒中進(jìn)行構(gòu)建。使用TaKaRa公司生產(chǎn)的BamHI和EcoRI內(nèi)切酶，Phaonacia公司生產(chǎn)的PGEX—3X，本組保存的菌株E.coliDE3、E.eoliDH5a、以及其他的分析純?cè)噭?/p>

2.方法

（1）構(gòu)建PGEX—3Xll97表達(dá)質(zhì)粒

使用E61質(zhì)粒作為模板，以1197基因讀框3及5端順序?yàn)橐罁?jù)，將下游引物和上游引物合成，并將其在50μLPCR反應(yīng)混合液中對(duì)其進(jìn)行94℃5min的變性，并對(duì)其進(jìn)行30循環(huán)擴(kuò)增。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。用BamHI和EcoRI雙酶切PGEX—3X，并使用低熔點(diǎn)膠回收法來(lái)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、常規(guī)連接和純化。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化得到了含有DE3鈣細(xì)胞的菌株，并對(duì)其含有1197基因的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

（2）在大腸桿菌DE3中表達(dá)PGEX—3X1197

將含有PGEX—3X1197質(zhì)粒的大腸桿菌DE3單菌落培養(yǎng)出來(lái)，將其加入300mL的LB培養(yǎng)瓶，比例為1：100。

（3）純化表達(dá)產(chǎn)物

對(duì)純化融合蛋白使用谷胱甘肽親和層析柱分離，并收集樣品。對(duì)融合蛋白使用FPLC的方法進(jìn)行純化。對(duì)包涵體進(jìn)行處理，使用300mL的菌液進(jìn)行破菌，并進(jìn)行10分鐘的離心，在3mL裂解緩沖液中進(jìn)行沉淀懸浮。

對(duì)純化融合蛋白使用FPLC進(jìn)行分離，并適當(dāng)濃縮包涵體樣品，使用A緩沖液進(jìn)行透析，用微孔濾膜過(guò)濾樣品，并進(jìn)行2mL的上樣。設(shè)計(jì)合適的NaCI濃度梯度，并對(duì)離子交換柱進(jìn)行洗脫，對(duì)樣品進(jìn)行收集。

（4）對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)行復(fù)性處理

主要是在27mL溶解緩沖液溶液中緩慢的加入經(jīng)過(guò)處理的包涵體，依次透析PBS、2mol/L尿素、4mol/L尿素、6mol/L尿素。離心所得到的樣品，然后使用谷胱甘肽S—轉(zhuǎn)移酶親和層對(duì)上清液進(jìn)行分離純化。

二、結(jié)果

1.鑒定與構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PGEX—3X1197

以已知的對(duì)蝦白斑病毒1197的基因序列3端及5端為基礎(chǔ)，將下游引物P2和上游引物P1合成出來(lái)，在對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，將對(duì)蝦白斑病毒1197基因得出來(lái)，并將其與載體PGEX—3X進(jìn)行連接，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。

2. 純化大腸桿菌DE3中PGEX—3X1197的產(chǎn)物

可以將PGEX—3X的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行編碼，然后將含有外源讀框的DNA片段插入，將連接外源基因產(chǎn)物的融合蛋白表達(dá)出來(lái)，并使用GST親和柱進(jìn)行純化。然而由于包涵體包涵了該基因的產(chǎn)物，難以進(jìn)行純化。

用8M尿素處理包涵體，在融合蛋白在透析后的上清中含量較高，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的透析，仍然沒有得到純化的融合蛋白。對(duì)包涵體進(jìn)行處理，并用FPLC陰離子交換層析法對(duì)上清樣品進(jìn)行分析，得到了4個(gè)小峰。根據(jù)對(duì)小峰的鑒定，得到了融合蛋白。

三、討論

從上世紀(jì)末開始，我國(guó)出現(xiàn)了對(duì)蝦白斑病毒，主要癥狀是蝦體的頭胸甲部位出現(xiàn)白斑，給我國(guó)的沿海對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。當(dāng)前的研究表明，在5‘端非編碼區(qū)，1197基因具有AAGGTT早期基因啟動(dòng)子元件、GTGT結(jié)構(gòu)域、TATA box。因此本文認(rèn)為這是一個(gè)病毒蛋白的調(diào)控因子，其能夠參與病毒復(fù)制。在本次研究中，載體使用了pGEx—3x表達(dá)，并對(duì)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行克隆，對(duì)大腸桿菌中的pGEX3X—1197進(jìn)行表達(dá)和誘導(dǎo)。

經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌的包含體重，該基因產(chǎn)物語(yǔ)其他基因產(chǎn)物有所不同，盡管裂解包含體之后能夠獲得較高表達(dá)量的產(chǎn)物，但是卻具有較大的純化難度。要使用去垢劑來(lái)裂解包含體、分離蛋白質(zhì)，例如鹽酸胍和尿素、SDS等。這也導(dǎo)致了表達(dá)產(chǎn)物的變性率較高，難以進(jìn)行純化分離。

本次試驗(yàn)使用的方法是蛋白質(zhì)復(fù)性方法，在尿素中進(jìn)行從高濃度到低濃度的透析，但是效果仍然不理想。這是由于GST的親和層析柱難以進(jìn)行結(jié)合。最后，本實(shí)驗(yàn)使用了透析包涵體、鹽酸胍和尿素處理，并在離析中使用了FPLC陰離子，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)該基因表達(dá)的融合蛋白的成功純化，此時(shí)NaCI梯度濃度為30%。至于該蛋白質(zhì)的功能是否會(huì)受到尿素引起的變性作用的影響，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的考證。

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