李俐

[摘要] 目的 研究七葉亭對大鼠血管平滑肌細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及分子機制。方法 離體培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞，分為高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組。采用MTT法檢測細胞的凋亡情況，采用熒光定量PCR檢測細胞中Bcl-2、Bax和caspases-9的mRNA含量。 結(jié)果 ①細胞凋亡：七葉亭處理后MTT值均低于對照組，且藥物劑量越高、MTT值越低；②基因mRNA含量：七葉亭處理后，Bcl-2的mRNA含量低于對照組，Bax和caspases-9的mRNA含量高于對照組；且藥物劑量越高，Bcl-2的mRNA含量越低，Bax和caspases-9的mRNA含量越高。結(jié)論 七葉亭處理能夠誘導大鼠血管平滑肌細胞發(fā)生凋亡，且抑制Bcl-2表達和促進Bax、caspases-9表達可能是藥物發(fā)揮作用的分子機制。

[關(guān)鍵詞] 七葉亭；血管平滑肌細胞；凋亡；血管再狹窄

[中圖分類號] R719.8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）09（a）-0004-02

Study on the Regulation Effect and Molecular Mechanisms of Esculetin on Rat Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis

LI Li

Department of Cardiovascular Medicine， Huadu District， Guangzhou City People's Hospital， Guangzhou， Guangdong Province， 510800 China

[Abstract] Objective To study the regulation effect and molecular mechanisms of esculetin on rat vascular smooth muscle cell apoptosis. Methods Rats' vascular smooth muscle cells were cultured and divided into high-dose group， middle-dose group， low-dose group and control group. Cell apoptosis was detected by MTT assay. Bcl-2， Bax and caspases-9 mRNA contents were detected by quantitative PCR. Results ①Cell apoptosis： after esculetin treatment， MTT values were lower than control group and the higher the dose， the lower the MTT value； ②mRNA content： after esculetin treatment， Bcl-2's mRNA levels were lower than control group， Bax and caspases-9 mRNA levels were higher than control group； the higher the dose， the lower the mRNA levels of Bcl-2 and the higher the mRNA levels of Bax and caspases-9. Conclusion Esculetin treatment can induce the apoptosis of rat vascular smooth muscle cells and inhibit the Bcl-2 expression and promote Bax and caspases-9 expression， which may play a role in the molecular mechanisms of drugs.

[Key words] Esculetin； Vascular smooth muscle cells； Apoptosis； Vascular restenosis

血管再狹窄是冠心病患者冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)后常見的并發(fā)癥，會嚴重影響疾病的預(yù)后。近年來的研究認為，血管平滑肌細胞增殖是造成血管再狹窄的重要途徑，誘導血管平滑肌細胞凋亡也成為了預(yù)防血管再狹窄的重要靶點[1]。七葉亭是一類天然香豆素類化合物，具有誘導腫瘤細胞凋亡、保護心肌細胞缺血再灌注損傷的作用。2012年4月—2014年4月期間該文分析了七葉亭對大鼠血管平滑肌細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年4月—2014年4月期間進行實驗，材料如下：雄性大鼠主動脈血管平滑肌細胞株購買于ATCC公司，細胞培養(yǎng)所用的試劑購買于Gibco公司，所用耗材購買于Nunc公司，MTT檢測試劑購買于Promega公司，PCR檢測試劑購買于Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理方法 將凍存的細胞從液氮罐中取出后常規(guī)復(fù)蘇和培養(yǎng)，處理時，七葉亭藥物組分別采用100 μM（高劑量組）、50 μM（中劑量組）、10 μM（低劑量組）的七葉亭處理（培養(yǎng)基中含有0.1%二甲基亞砜），溶劑對照組用含0.1%二甲基亞砜的高糖培養(yǎng)基處理。

1.2.2 細胞活力檢測方法 細胞處理24 h時，在培養(yǎng)基中直接加入MTT溶液，孵箱中孵育4 h，而后在酶標儀上讀取490 nm處的吸光值，參照吸光值計算細胞活力。

1.2.3 基因mRNA含量檢測方法 細胞處理24 h時，加入Trizol裂解液后抽提細胞中的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行熒光定量PCR反應(yīng)，分別擴增Bcl-2、Bax和caspases-9，計算mRNA含量。

1.3 統(tǒng)計方法

通過SPSS 18.0軟件錄入檢測所得數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗，按照P<0.05判斷差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞活力

溶劑對照組的MTT值（100.00±16.69），低劑量組的MTT值（65.52±8.72）、中劑量組的MTT值（40.12±6.52）、高劑量組的MTT（18.89±2.42）。方差分析顯示，各處理組間的MTT值差異有統(tǒng)計學意義（F=14.852，P<0.05）；LSD法兩兩比較顯示，藥物劑量越高、MTT值越低。

2.2 基因的mRNA含量

方差分析顯示，各處理組間Bcl-2、Bax和caspases-9的mRNA含量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LSD法兩兩比較顯示，藥物劑量越高，Bcl-2的mRNA含量越低，Bax和caspases-9的mRNA含量越高。見表1。

表1 各組間基因的mRNA含量比較（x±s）

3 討論

冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)是臨床常用的冠心病治療方法，能夠取得確切療效，擴張冠脈管腔、恢復(fù)心肌血供。部分患者會在冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)后出現(xiàn)血管再狹窄，進而導致心肌缺血缺氧、病情反復(fù)[2]。已有研究顯示，在再狹窄的發(fā)生和發(fā)展過程中，血管平滑肌細胞增殖、遷移以及凋亡不足發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，誘導血管平滑肌細胞凋亡、抑制血管平滑肌細胞增殖是預(yù)防冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)后再狹窄的理想靶點[3]。

近年來，臨床學者致力于探尋能夠促進血管平滑肌細胞凋亡的藥物。七葉亭是一類天然香豆素類化合物，為傳統(tǒng)中藥的有效成份之一，具有廣泛的生物學作用[4]。在腫瘤中的研究顯示，該藥物具有誘導DNA氧化損害以及抑制腫瘤細胞增殖的作用；在心血管系統(tǒng)中的研究顯示，七葉亭具有緩解心肌細胞缺血再灌注損傷的作用[5]?；谝陨险J識，我們推測七葉亭具有預(yù)防血管再狹窄、誘導血管平滑肌細胞凋亡的作用。

在該研究中，研究了七葉亭對大鼠血管平滑肌細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及分子機制。MTT法是判斷細胞活力最簡便的方法，由實驗結(jié)果可知，七葉亭處理組的MTT值低于溶劑對照組。這就說明七葉亭能夠降低大鼠血管平滑肌細胞的活力，誘導細胞凋亡。進一步分析凋亡相關(guān)的分子可知，七葉亭處理能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達，且藥物劑量越高，Bcl-2的mRNA含量越低，Bax和caspases-9的mRNA含量越高。已有學者報道，Bcl家族蛋白是調(diào)節(jié)線粒體途徑的關(guān)鍵分子，其中Bcl-2屬于抗凋亡基因，Bax屬于促凋亡基因[6-7]；Caspase-9是Caspase家族中的凋亡執(zhí)行分子[8]。結(jié)合該研究結(jié)果及國內(nèi)學者關(guān)于凋亡分子功能的報道[6-8]進行分析可知，葉亭誘導細胞凋亡的分子機制可能是抑制Bcl-2的表達、增加Bax和caspases-9的表達。這一結(jié)果是對王志強[5]研究的進一步深入，直接闡明了七葉亭緩解心肌細胞缺血再灌注損傷的分子機制。

綜合以上討論可得出結(jié)論：七葉亭處理能夠誘導大鼠血管平滑肌細胞發(fā)生凋亡，且抑制Bcl-2表達和促進Bax、caspases-9表達可能是藥物發(fā)揮作用的分子機制。

[參考文獻]

[1] 陳潔，熊國祚.血管平滑肌細胞凋亡在血管再狹窄中作用的研究進展[J].臨床與病理雜志，2014，34（1）：65-70.

[2] Liang M，Liang A，Wang Y，et al.Smooth muscle cells from the anastomosed artery are the major precursors for neointima formation in both artery and vein grafts[J].Basic Res Cardiol，2014，109（5）：1-12.

[3] Cho JH，Shin JC，Cho JJ，et al.Esculetin（6，7-dihydroxycoumarin）： a potential cancer chemopreventive agent through suppression of Sp1 in oral squamous cancer cells[J].Int J Oncol，2015，46（1）：265-271.

[4] 戴榕，鄭瓊莉，徐全勝，等.七葉內(nèi)酯對大鼠血管平滑肌細胞增殖的抑制及其機制[J].華中科技大學學報，2009，38（2）：239-242.

[5] 王志強，夏勇.七葉亭預(yù)處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].成都醫(yī)學院學報，2011，6（1）：49-51.

[6] 馬琦，邊云飛，白瑞，等.吡咯列酮通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡途徑促進大鼠血管平滑肌細胞鈣化[J].中國醫(yī)藥指南，2015，13（7）：13-16.

[7] 常亮，付春子，馬賢德.補脾益氣中藥對脾氣虛證大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)PDGF、bcl-2、bax表達的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13（5）：77-78.

[8] 榮曉鳳，李榮亨，王維.氣虛血瘀證大鼠血管平滑肌細胞 bcl-2及 bax相關(guān)凋亡因子的表達[J].中國老年學雜志，2010，30（5）：648-650.

（收稿日期：2015-06-05）