李輝敏

（九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000）

聚酰胺純化刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮的研究

李輝敏

（九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000）

目的 研究聚酰胺樹(shù)脂純化刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮的工藝條件。方法 以總黃酮的吸附率、純化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察聚酰胺樹(shù)脂對(duì)刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮的吸附和洗脫條件。結(jié)果 所得最佳純化工藝：上樣液pH值為5，上樣溶液黃酮質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為2.0 mg/ml，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2.0 BV/h。結(jié)論聚酰胺樹(shù)脂能有效富集、純化刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮。關(guān)鍵詞：刺頭復(fù)葉耳蕨；總黃酮；聚酰胺樹(shù)脂；純化工藝

刺頭復(fù)葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）為鱗毛蕨科復(fù)葉耳蕨屬植物，廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶濕潤(rùn)區(qū)域，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，具有清熱利濕、抗菌消炎等作用，民間用于治療急性黃疸型肝炎、痢疾、燙火傷等，其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物［1］。有研究表明鱗毛蕨類植物有包括抗病毒、抗腫瘤等藥理作用，產(chǎn)生這些藥理作用的成分為黃酮類化合物［2］。本研究經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［3，4］，選擇60-90目的聚酰胺來(lái)純化刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮，建立純化工藝，為刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮的開(kāi)發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

刺頭復(fù)葉耳蕨采自江西省星子縣，經(jīng)九江學(xué)院高春華教授鑒定為鱗毛蕨科（Dryopteridaceae）復(fù)葉耳蕨屬（Arachniodes）刺頭復(fù)葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）的根莖。對(duì)照品：蘆?。ㄖ袊?guó)生物制品檢定所，批號(hào)100080-200306）；Al（NO3）3，上海科思精密化學(xué)品公司；60-90目聚酰胺，河北滄州化工有限公司；其他所有試劑（均為分析純），汕頭市西隴化工有限公司。

1.2 儀器

電子分析天平（BT224S型），德國(guó)賽多利斯；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA），上海亞榮生化儀器廠；真空干燥箱，上海精密儀器有限公司。

2 方法

2.1 總黃酮含量測(cè)定

利用紫外-可見(jiàn)分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Al（NO3）3顯色法，在486.4 nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線［5］，得到線性回歸方程：Y=0.0121X-0.0322，R2=0.9998，線性關(guān)系在17.20～ 68.80 μg/ml范圍內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定各樣品中總黃酮的含量。

2.2 刺頭復(fù)葉耳蕨總提取物溶液的制備

取一定量刺頭復(fù)葉耳蕨根莖粉末以60%乙醇，固液比1∶20，超聲提取3次，每次超聲提取時(shí)間為30 min。將所得提取液經(jīng)過(guò)濾后減壓濃縮至一定濃度，冷凍干燥得復(fù)葉耳蕨總提取物干燥粉末，測(cè)定該固體粉末中總黃酮含量為46.45%。取200 mg復(fù)葉耳蕨總提取物凍干粉用蒸餾水定溶于100 ml容量瓶，超聲溶解，搖勻即得供試品溶液。

2.3 聚酰胺預(yù)處理

取60-90目的聚酰胺用95%乙醇浸泡24 h，用乙醇沖洗至洗出液加蒸餾水無(wú)白色渾濁，再用大量的蒸餾水洗至無(wú)醇味。

2.4 聚酰胺純化條件的選擇

2.4.1 上樣液pH值選擇 取供試品溶液10 ml各5份，分別滴加稀鹽酸或稀氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為3、4、5、6、7。另外分別取2.0 g已預(yù)處理好的60-90目聚酰胺樹(shù)脂5份，濕法裝柱，取10 ml供試品溶液上樣，控制流速為2.0 BV/h進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用蒸餾水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫至洗脫終點(diǎn)，收集洗脫液，減壓濃縮成浸膏后定容于25 ml容量瓶中，測(cè)定吸光度，計(jì)算聚酰胺樹(shù)脂的吸附率。

2.4.2 上樣液濃度選擇 分別取2.0 g已預(yù)處理好的60-90目聚酰胺樹(shù)脂3份，濕法裝柱，精密吸取不同質(zhì)量濃度的刺頭復(fù)葉耳蕨總提取物溶液各10 ml，控制流速為2.0 BV/h進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用蒸餾水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫至洗脫終點(diǎn)，收集洗脫液，減壓濃縮至20 ml，測(cè)定吸光度，計(jì)算聚酰胺樹(shù)脂的吸附率。

2.4.3 洗脫溶劑選擇 分別取2.0 g已預(yù)處理好的60-90目聚酰胺樹(shù)脂5份，濕法裝柱，取10 ml供試品溶液上樣，控制流速為2.0 BV/h，用蒸餾水沖洗至清洗液的Molish反應(yīng)無(wú)現(xiàn)象，再分別用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮成浸膏后定容于25 ml容量瓶中，測(cè)定吸光度，優(yōu)化篩選洗脫溶劑。

2.4.4 泄露曲線考察 取2.0 g已預(yù)處理好的60-90目聚酰胺樹(shù)脂，濕法裝柱，加入100 ml供試品溶液，取蒸餾水進(jìn)行沖洗，直至清洗液的Molish反應(yīng)無(wú)現(xiàn)象。在流速為2.0 BV/h的條件下，取70%乙醇對(duì)樹(shù)脂中所吸附的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮進(jìn)行解吸附，收集洗脫液，以每10 ml為一個(gè)流份，減壓濃縮成浸膏后定容于100 ml容量瓶中，分別依法測(cè)定吸光度，以累計(jì)總體積為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線，確定最佳上樣量。

2.4.5 洗脫流速選擇 取2.0 g已預(yù)處理好的60-90目聚酰胺樹(shù)脂3份濕法裝柱，取10 ml供試品溶液上樣，取蒸餾水進(jìn)行沖洗，直至清洗液的Molish反應(yīng)無(wú)現(xiàn)象。分別控制流速為1.0、2.0、3.0 BV/h，取70%乙醇對(duì)樹(shù)脂中所吸附的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮進(jìn)行解吸附。收集洗脫液，減壓濃縮至20 ml，測(cè)定其黃酮含量，計(jì)算解吸附率。

2.4.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 取樣品溶液3份，按以上所得最佳條件進(jìn)行分離純化，測(cè)定計(jì)算所得黃酮洗脫率，并計(jì)算RSD值。

3 結(jié)果

3.1 上樣液pH值選擇

結(jié)果見(jiàn)圖1，上樣液pH值變化可影響聚酰胺樹(shù)脂的吸附率。當(dāng)pH=5.0時(shí)聚酰胺樹(shù)脂的吸附率最大。當(dāng)溶液pH值高于樣品溶液中黃酮類成分的pKa值時(shí)，樣品易以鹽的形式而不以游離狀態(tài)存在，不利于吸附；而當(dāng)溶液pH值低于4時(shí)，吸附率較低，這可能是由于黃酮類成分在酸性過(guò)強(qiáng)的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)檠瘥}，不利于吸附。當(dāng)pH=5.0時(shí)，樣品溶液中黃酮類化合物保持分子狀態(tài)，以游離形式存在，易被吸附，故此pH條件下吸附量最大。

圖1 上樣液pH值對(duì)聚酰胺樹(shù)脂吸附率的影響

3.2 上樣液濃度選擇

結(jié)果見(jiàn)圖2，聚酰胺樹(shù)脂對(duì)樣品溶液中黃酮的吸附率隨著上樣溶液濃度的增加而有所降低，提示樣品溶液中黃酮質(zhì)量濃度較低時(shí)易于吸附與解吸附，同時(shí)考慮上樣體積增加對(duì)生產(chǎn)效率有一定降低作用。本研究最終選擇將樣品溶液黃酮質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為2.0 mg/ml后進(jìn)行純化。

圖2 上樣液濃度對(duì)吸附率的影響

3.3 洗脫溶劑選擇

結(jié)果見(jiàn)圖3，乙醇濃度低于70%時(shí)，對(duì)聚酰胺樹(shù)脂柱上黃酮的洗脫作用較弱，而當(dāng)乙醇濃度高于70%時(shí)，對(duì)黃酮的洗脫作用增加不明顯，從節(jié)省溶劑等方面考慮，最終選擇以70%乙醇作為聚酰胺樹(shù)脂純化條件下的洗脫溶劑。

圖3 不同洗脫溶劑對(duì)聚酰胺樹(shù)脂解吸附率的影響

3.4 泄露曲線考察

結(jié)果見(jiàn)圖4，當(dāng)上樣量過(guò)載時(shí)，黃酮發(fā)生泄漏，隨清洗液流出，當(dāng)用蒸餾水清洗到第8個(gè)流份時(shí)，所得累計(jì)流份中黃酮含量幾乎不再發(fā)生變化，證明此時(shí)過(guò)載的黃酮已隨清洗液全部流出。計(jì)算清洗液中黃酮含量，可知2 g聚酰胺樹(shù)脂對(duì)黃酮的飽和吸附量為79 mg，所以要求每克聚酰胺樹(shù)脂總黃酮上樣量不能超過(guò)39 mg。

圖4 泄露曲線

3.5 洗脫流速選擇

結(jié)果見(jiàn)圖5，洗脫流速分別為1.0、2.0、3.0 BV/h時(shí)，吸附率相應(yīng)有一定程度的下降。當(dāng)洗脫流速為1.0 BV/h時(shí)，吸附與解吸作用最好。同時(shí)考慮到洗脫時(shí)間的控制，生產(chǎn)效率的提高，本研究最終選擇2.0 BV/h作為洗脫流速。

圖5 流速對(duì)吸附率的影響

3.6 純化工藝驗(yàn)證

精密稱取已經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺樹(shù)脂2 g各3份，濕法裝柱；按上述實(shí)驗(yàn)所得到的最佳純化工藝條件（即上樣液pH值為5，上樣溶液黃酮質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為2.0 mg/ml，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2.0 BV/h）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行3次，收集洗脫液，減壓濃縮后按標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法顯色得到待測(cè)溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的洗脫率，結(jié)果顯示：平均洗脫率為79.50%，RSD為3.98%，表明該純化工藝穩(wěn)定可行（見(jiàn)表1）。該純化后的溶液經(jīng)減壓濃縮冷凍干燥后得到的干燥粉末中黃酮含量為71.64%，比純化前提高了25.19%。

表1 刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮純化工藝驗(yàn)證結(jié)果（%）

4 結(jié)論

本研究建立了以聚酰胺樹(shù)脂純化的方法獲得刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮，得出其最佳純化工藝條件：上樣液pH值為5，上樣溶液黃酮質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為2.0 mg/ml，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2.0 BV/h，洗脫率可達(dá)到79.50%。該條件下所得洗脫液經(jīng)減壓回收溶劑，冷凍干燥后得到黃酮含量為71.64%的刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮凍干粉。聚酰胺樹(shù)脂純化條件的建立為刺頭復(fù)葉耳蕨中黃酮成分的純化提供了依據(jù)，從而為進(jìn)一步研究刺頭復(fù)葉耳蕨中黃酮成分的藥理活性提供基礎(chǔ)。

［1］周道年，阮金蘭，蔡亞玲.復(fù)葉耳蕨地上部分黃酮類化合物［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（16）：1218-1220.

［2］李輝敏.復(fù)葉耳蕨屬植物研究進(jìn)展［J］.九江醫(yī)學(xué)，2009（3）：91-93.

［3］胡軍萍，依再提古麗·司馬義，楊建華.酒花黃酮的純化工藝［J］.食品科學(xué)，2013，34（12）：40-44.

［4］吳新榮，劉志剛，顏仁梁，等.聚酰胺顆粒分離純化土茯苓總黃酮研究［J］.中藥材，2009，32（10）：1606-1609.

［5］張玉祥，邱蔚芬，銀杏葉超聲波提取工藝研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17 （5）：784-785.

R285.5

A

1671-1246（2015）09-0104-03

注：本文系江西省教育廳資助項(xiàng)目（GJJ12737）；江西省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（2012A014）