劉麗莎，彭義交，鮑魯生，田　旭，呂曉蓮，白　潔，李玉美，郭　宏，*

（1.北京食品科學(xué)研究院北京市食品研究所，北京 100162；2.北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司，北京 100053）

大豆浸泡過(guò)程中腐敗微生物對(duì)豆?jié){品質(zhì)的影響

劉麗莎1，彭義交1，鮑魯生1，田旭1，呂曉蓮2，白潔1，李玉美1，郭宏1，*

（1.北京食品科學(xué)研究院北京市食品研究所，北京 100162；2.北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司，北京 100053）

通過(guò)對(duì)大豆浸泡過(guò)程中腐敗微生物種類(lèi)及數(shù)量開(kāi)展研究，經(jīng)致腐細(xì)菌回接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探明豆?jié){腐敗現(xiàn)象與致腐細(xì)菌的關(guān)系，為豆?jié){穩(wěn)定性控制及豆制品加工自動(dòng)化提供依據(jù)。從大豆浸泡水中分離3 株優(yōu)勢(shì)菌DF-1、DF-2和DF-3，結(jié)合形態(tài)學(xué)及16S rDNA序列分析，分別鑒定為短穩(wěn)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和乳酸乳球菌。將優(yōu)勢(shì)菌分別回接至滅菌豆?jié){，于25 ℃保藏12 h，理化指標(biāo)結(jié)果表明3 種微生物對(duì)豆?jié){品質(zhì)影響有較大差異：短穩(wěn)桿菌產(chǎn)黃色素，在豆?jié){表面形成黃色菌膜并產(chǎn)生腐臭味；產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使豆?jié){形成蜂窩狀凝乳，腐敗變餿；乳酸乳球菌產(chǎn)酸使豆?jié){凝固。本研究為豆制品自動(dòng)化生產(chǎn)過(guò)程中控制豆?jié){品質(zhì)及加工穩(wěn)定性提供參考。

豆?jié){；浸泡工藝；腐敗微生物

北豆腐作為植物蛋白的主要來(lái)源，富含蛋白質(zhì)、微量元素和不飽和脂肪酸，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是我國(guó)消費(fèi)量較大的日常食品［1-2］。同時(shí)由于大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，生產(chǎn)過(guò)程中容易被微生物污染［3］，尤其是在煮漿之前，微生物污染極其嚴(yán)重［4］。目前國(guó)內(nèi)北豆腐生產(chǎn)企業(yè)大都采用半自動(dòng)化設(shè)備沿用傳統(tǒng)加工工藝，大豆磨漿之前需浸泡8～12 h，微生物增殖迅速，企業(yè)在加工過(guò)程中需換水避免微生物過(guò)量繁殖，不僅耗費(fèi)大量水資源，還給環(huán)境造成嚴(yán)重污染。此外，由于泡豆工序耗時(shí)長(zhǎng)，企業(yè)一般在上午磨漿制備全天所用豆?jié){，生豆?jié){放置到下午時(shí)易出現(xiàn)發(fā)黏、發(fā)臭、pH值下降、表面黃膜等腐敗現(xiàn)象，嚴(yán)重影響豆?jié){穩(wěn)定性及豆腐品質(zhì)，給消費(fèi)者帶來(lái)潛在的安全問(wèn)題；嚴(yán)重腐敗時(shí)，只能作為廢液排放，給企業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的影響。

目前已有較多針對(duì)豆腐腐敗微生物的研究，關(guān)于豆?jié){制備及放置過(guò)程中的微生物腐敗作用還沒(méi)有人報(bào)道。本研究針對(duì)豆制品加工過(guò)程中腐敗微生物種類(lèi)及增殖趨勢(shì)開(kāi)展研究，分析腐敗菌對(duì)豆?jié){的腐敗作用，為開(kāi)發(fā)新型大豆浸泡工藝，控制豆?jié){品質(zhì)及穩(wěn)定性提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大豆：無(wú)蟲(chóng)蝕、無(wú)霉變大豆，取自北京二商希杰食品有限責(zé)任公司。

溶菌酶、蛋白酶K、細(xì)菌總DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 寶生物技術(shù)有限公司；引物合成及序列測(cè)定由北京博邁德生物技術(shù)有限公司完成；其余試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國(guó)TechNet公司；PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；NDJ-1旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) 上海尼潤(rùn)設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1致腐細(xì)菌分離及檢測(cè)

大豆采用傳統(tǒng)浸泡工藝，即用3 倍體積自來(lái)水漂洗1 次，用3 倍自來(lái)水浸泡大豆，室溫條件下（約25 ℃）浸泡12 h，每隔3 h取樣檢測(cè)菌落總數(shù)［5］。將長(zhǎng)出的菌落按菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果進(jìn)行分離純化。

1.3.2菌株初步鑒定

采用細(xì)菌總DNA試劑盒提取腐敗菌DNA，16S rRNA鑒定引物：LPW57（5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、LPW205（5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’）［6］；PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 11.50 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10 μL；反應(yīng)程序：94 ℃初始變性5 min，94 ℃變性1 min，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min［7］。PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后，連接T載體后測(cè)序（北京博邁德生物技術(shù)有限公司），將結(jié)果與GenBank中收錄的其他菌株序列進(jìn)行分析比對(duì)，初步確定大豆浸泡過(guò)程的腐敗微生物種類(lèi)。

1.3.3腐敗菌對(duì)豆?jié){的微生物效應(yīng)研究

新鮮豆?jié){經(jīng)115 ℃、20 min殺菌后，按2%接種DF-1、DF-2、DF-3，于25 ℃培養(yǎng)，每3 h取樣檢測(cè)，研究腐敗菌對(duì)豆?jié){的微生物效應(yīng)。

1.3.3.1感官評(píng)價(jià)

挑選豆制品加工經(jīng)驗(yàn)豐富的人員對(duì)豆?jié){色澤、氣味及質(zhì)地進(jìn)行評(píng)價(jià)，衡量豆?jié){的品質(zhì)及腐壞程度。

1.3.3.2活菌數(shù)測(cè)定

無(wú)菌吸取豆?jié){樣品按10 倍梯度稀釋至合適梯度，用稀釋平板法測(cè)定各組細(xì)菌數(shù)。

1.3.3.3pH值測(cè)定

采用pH計(jì)在25 ℃條件下測(cè)定豆?jié){樣品的pH值。

1.3.3.4黏度測(cè)定

采用NDF-1旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)，在25 ℃測(cè)定酸乳樣品的黏度。測(cè)定條件：27#轉(zhuǎn)子，80 r/min，30 s取值。

2　結(jié)果與分析

2.1腐敗菌在大豆浸泡過(guò)程中的生長(zhǎng)規(guī)律研究

圖1　浸泡過(guò)程微生物生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curves of spoilage bacteria during soybean soaking

圖1顯示，在大豆浸泡過(guò)程中，微生物呈直線上升趨勢(shì)，經(jīng)25 ℃浸泡12 h，活菌數(shù)從105CFU/mL增長(zhǎng)到108CFU/mL，其中DF-3（乳酸乳球菌）的初始菌落數(shù)及增殖速度最快，浸泡結(jié)束可達(dá)108CFU/mL，DF-1和DF-2活菌數(shù)分別增至107CFU/mL和106CFU/mL，泡豆水變渾濁，產(chǎn)生大量氣泡。在工業(yè)化制漿過(guò)程中，為降低微生物污染采用流水浸泡方式，浪費(fèi)大量水資源，且給企業(yè)帶來(lái)巨大的治污負(fù)擔(dān)，流水浸泡過(guò)程還會(huì)帶走部分大豆的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)豆腐出品率造成影響。

2.2腐敗菌的分離純化

挑取單菌落劃線分離純化，并觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

圖2　腐敗菌菌落形態(tài)圖Fig.2　Colonial morphology of three spoilage bacteria from soaked soybeans

如圖2所示，大豆在浸泡過(guò)程中主要有3 種不同形態(tài)的菌落存在，其菌體形態(tài)如圖3所示。DF-1在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上為典型的黃色菌落，邊緣整齊，光滑有光澤，顯微鏡下為革蘭氏陰性球桿菌。DF-2為較大乳白色圓形菌落，邊緣不規(guī)則，革蘭氏染色呈陰性。DF-3為白色針尖狀小菌落，顯微鏡下為革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌。DF-1、DF-2的菌落形態(tài)與韓磊等并所述豆?jié){中菌落形態(tài)相似［8-9］，但對(duì)于腐敗菌的種類(lèi)及對(duì)豆?jié){的腐敗作用并未涉及。

圖3　腐敗菌細(xì)胞形態(tài)圖Fig.3　Morphology of three spoilage bacteria from soaked soybeans

2.316S rDNA序列同源性分析

提取菌株的總DNA為模板，以引物L(fēng)PW57、LPW205進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp的目的片段，測(cè)序結(jié)果顯示DF-1、DF-2、DF-3的16S rDNA片段長(zhǎng)度分別為1 384、1 420、1 420 bp（結(jié)果未列出），經(jīng)NCBI中BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，菌株DF-1與Empedobacter brevis LMG 4011（Genbank序列號(hào)：NR_042471.2）同源性為100%，菌株DF-2與Enterobacter aerogenes EA1509E（Genbank序列號(hào)：FO203355.1）同源性為99%，DF-3與Lactococcus lactis PON10072（GenBank序列號(hào)：KC417004.1）同源性為99%。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)，將3 株腐敗菌初步鑒定為短穩(wěn)桿菌（舊稱(chēng)短黃桿菌Empedobacter brevis）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）及乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。本實(shí)驗(yàn)中豆?jié){腐敗微生物豆腐等豆制品中微生物種類(lèi)有較大差別，主要與豆制品加工過(guò)程需高溫煮漿有關(guān)。非發(fā)酵類(lèi)豆制品主要為耐熱芽孢桿菌［10-11］及后期污染的腸道菌［12-13］，此外還存在假單胞菌［14-15］、乳酸菌［16］和吉氏庫(kù)特氏菌［17］等腐敗微生物，研究人員已開(kāi)展豆腐腐敗微生物控制研究［18-19］，但影響豆制品加工過(guò)程中豆?jié){品質(zhì)及穩(wěn)定性的微生物種類(lèi)還未有報(bào)道，其微生物種類(lèi)及數(shù)量主要與大豆原料中攜帶的微生物有關(guān)。

2.4腐敗菌對(duì)豆?jié){品質(zhì)的影響研究

2.4.1感官評(píng)價(jià)

接種后的豆?jié){感官變化如表1所示，25 ℃放置12 h后樣品如圖4所示。

表1　感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table1　Sensory evaluation of inoculated soymilk during storage at 25 ℃

圖4　微生物對(duì)豆?jié){感官品質(zhì)的影響Fig.4　Effects of three spoilage bacteria on appearance of soymilk

豆?jié){滅菌后為乳白色，流體狀，豆香味濃郁，放置12 h內(nèi)無(wú)明顯感官變化，pH值、色澤、黏度、氣味及微生物均無(wú)明顯變化。DF-1放置9 h，表面開(kāi)始長(zhǎng)黃膜，并有輕微的臭味，由于短穩(wěn)桿菌為嚴(yán)格好氧菌［20］，且能產(chǎn)生黃色素，表面黃膜可能是DF-1形成的菌膜。DF-2為產(chǎn)氣菌，從6 h后開(kāi)始產(chǎn)生大量氣泡，呈鼻涕狀半流體，放置12 h呈蜂窩狀凝乳，有濃郁的腐臭味，可能與其產(chǎn)生大量生物胺有關(guān)。接種乳酸乳球菌的樣品放置12 h產(chǎn)生類(lèi)似酸乳的凝乳塊，無(wú)明顯的腐臭味，有較濃郁的發(fā)酵酸味。

2.4.2活菌數(shù)變化

圖5　腐敗菌在豆?jié){中的生長(zhǎng)曲線Fig.5　Growth curve of three spoilage bacteria in soymilk

豆?jié){中微生物活菌數(shù)變化趨勢(shì)如圖5所示，3 株腐敗菌在豆?jié){中的生長(zhǎng)速度及對(duì)豆?jié){的微生物效應(yīng)均有差異。3株腐敗菌以2%（105CFU/mL）接種后，在前3 h處于遲緩期，活菌數(shù)均保持穩(wěn)定，3 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由于樣品溫度為25 ℃，比適宜生長(zhǎng)溫度下增長(zhǎng)速率緩慢。培養(yǎng)9 h，DF-2和DF-3活菌數(shù)分別為7.5×106CFU/mL和8.9×106CFU/mL，對(duì)樣品的pH值、感官有較明顯的影響。DF-1活菌數(shù)增長(zhǎng)速度較慢，放置12 h后活菌數(shù)為9.8×105CFU/mL。由于DF-1為嚴(yán)格好氧菌，DF-2及DF-3為兼性厭氧菌，故DF-1在靜置豆?jié){中生長(zhǎng)速度較慢。

2.4.3腐敗菌對(duì)豆?jié){理化性質(zhì)的影響

接種3 株腐敗菌后，定期測(cè)定豆?jié){的pH值及黏度變化，結(jié)果如圖6和7所示。

圖6　腐敗菌對(duì)豆?jié){pH值的影響Fig.6　Effects of three spoilage bacteria on pH value of soymilk

圖7　腐敗菌對(duì)豆?jié){黏度的影響Fig.7　Effects of three spoilage bacteria on viscosity of soymilk

從圖6、7可看出，DF-2、DF-3對(duì)豆?jié){的pH值及黏度影響較大，均在9 h出現(xiàn)顯著的變化，pH值下降，黏度上升。微生物生長(zhǎng)使脂肪分解成脂肪酸或碳水化合物分解成有機(jī)酸，使豆?jié){pH值下降，引起豆?jié){蛋白凝聚，形成凝乳或變稠。研究表明產(chǎn)氣腸桿菌及乳酸乳球菌均可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸［21］，DF-2、DF-3黏度升高可能由酸凝乳所致。DF-1（穩(wěn)桿菌屬）屬于非發(fā)酵型微生物，豆?jié){的pH值及黏度并無(wú)明顯變化。這3 類(lèi)菌對(duì)高溫耐受性普遍較低，基本可在煮漿過(guò)程中殺滅（95 ℃、5～10 min）［22］，在成品豆腐中檢出率較低，但由于生豆?jié){加熱前無(wú)其余殺菌措施，在溫度適宜條件下，腐敗菌大量繁殖，導(dǎo)致豆?jié){腐敗變質(zhì)，從而使豆腐等豆制品的出品率下降或品質(zhì)劣變。

3　結(jié) 論

豆?jié){品質(zhì)不穩(wěn)定是目前國(guó)內(nèi)豆制品企業(yè)實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化生產(chǎn)的行業(yè)瓶頸。由于泡豆及制漿設(shè)備為敞開(kāi)式，原料及環(huán)境中微生物污染嚴(yán)重，加工過(guò)程微生物生長(zhǎng)繁殖迅速，導(dǎo)致豆?jié){的理化性質(zhì)不穩(wěn)定，難以在點(diǎn)腦過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，影響豆腐等豆制品生產(chǎn)效率及品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大豆浸泡過(guò)程中主要腐敗微生物開(kāi)展研究，確定引起豆?jié){腐敗的主要微生物為短穩(wěn)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌及乳酸乳球菌，并分析了豆?jié){品質(zhì)劣變的主要原因，短穩(wěn)桿菌產(chǎn)生色素引起豆?jié){表面發(fā)黃，產(chǎn)生腐臭味；產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣，導(dǎo)致豆?jié){黏度增大，形成蜂窩狀凝乳，有腐臭味；乳酸乳球菌產(chǎn)酸導(dǎo)致豆?jié){凝乳，對(duì)豆?jié){的氣味無(wú)太大影響。短穩(wěn)桿菌是一類(lèi)條件致病菌可引發(fā)敗血癥［23-24］，目前研究主要應(yīng)用于植物病蟲(chóng)害生物防治；產(chǎn)氣腸桿菌是食品中常見(jiàn)的腐敗菌，代謝形成尸胺、腐胺等生物胺產(chǎn)生嚴(yán)重腐臭味［25］，帶來(lái)潛在的質(zhì)量及安全問(wèn)題。由于這兩類(lèi)菌較少出現(xiàn)在成品豆腐中，未引起研究人員的重視，在豆制品相關(guān)研究中的報(bào)道較少，對(duì)于其安全性、致病性研究較少。后續(xù)需針對(duì)豆制品加工中腐敗微生物的安全性及控制開(kāi)展研究，提高豆?jié){穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)豆制品加工自動(dòng)化生產(chǎn)，確保豆制品質(zhì)量與安全。

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Growth of Spoilage Microorganisms during Soaking of Soybean and Their Effects on Soymilk Quality

LIU Lisha1， PENG Yijiao1， BAO Lusheng1， TIAN Xu1， L? Xiaolian2， BAI Jie1， LI Yumei1， GUO Hong1，*
（1. Beijing Food Research Institute， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100162， China；2. Beijing Er Shang Group Co. Ltd.， Beijing 100053， China）

In this research， three spoilage microorganisms named DF-1， DF-2 and DF-3， respectively were separated from soaked soybeans. Based on their morphological and physiological characteristics， and 16S rDNA analysis， these three strains were identifi ed as Empedobacter brevis， Enterobacter aerogenes and Lactococcus lactis， respectively. To investigate their effects on soymilk quality， sterile soymilk was inoculated with each of these spoilage strains and stored at 25 ℃ and changes in physicochemical indicators were measured during 12 h of storage. Physicochemical properties of soymilk were affected signifi cantly differently by the three spoilage bacteria. When being cultivated in soymilk， DF-1 produced yellow fi lms with putrefactive odor on the surface of soymilk while DF-2 produced gas and acid and formed a honeycomb-like gel indicating spoilage of soymilk. DF-3 also produced acid and caused coagulation of soymilk like yogurt. This research can lay a foundation for quality and processing stability control of soymilk during automatic production of soybean products.

soymilk； soaking process； spoilage microorganisms

TS214.2

A

1002-6630（2015）14-0161-04

10.7506/spkx1002-6630-201514031

2014-10-28

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102105）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B03-2）

劉麗莎（1989—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛按x產(chǎn)物。E-mail：liulisha0616@sina.com

郭宏（1961—），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槎怪破芳庸ぜ熬C合利用。E-mail：guohong1961@sina.com