何悅銘，王　杉，揭琴豐，邱偉華，黃曉婉，鄧澤元，*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

手性色譜法測(cè)定L-乳酸鋅

何悅銘1，王杉2，揭琴豐2，邱偉華2，黃曉婉1，鄧澤元1，*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

研究高效液相色譜法測(cè)定乳酸鋅中L-乳酸鋅含量的方法，并對(duì)此方法學(xué)進(jìn)行探討。采用OA-5000手性色譜柱，1 mmol/L CuSO4·5H2O溶液為流動(dòng)相，流速為1 mL/min進(jìn)行色譜分離DL-乳酸鋅，分離效果好。L-乳酸鋅在0.147～3.675 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99 9 9（n=6）；精密度 實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.044%；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.061%；平均回收率達(dá)（99.8±1.90）%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.90%。表明此方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于L-乳酸鋅的準(zhǔn)確測(cè)定和品質(zhì)監(jiān)控。

高效液相色譜法；乳酸鋅；手性

乳酸鋅作為一種補(bǔ)充微量元素鋅的新型營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，無(wú)臭、味甘甜，且價(jià)格適中；其相對(duì)于硫酸鋅等補(bǔ)鋅劑更易被人體吸收，對(duì)腸道無(wú)刺激［1-3］，具有增強(qiáng)食欲［4］、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、提高肌體免疫力［5-6］和維持皮膚健康［7］等作用，可廣泛用于食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域［8］?，F(xiàn)代工業(yè)中乳酸鋅主要是通過氧化鋅與乳酸反應(yīng)，硫酸鋅與乳酸鈣合成［9］而得。

合成乳酸鋅的乳酸中含有一個(gè)手性碳原子，因此具有旋光性［10］。人體和動(dòng)物體內(nèi)存在的L-乳 酸脫氫酶只能代謝L-乳酸，不能分解吸收D-乳酸［11］。攝入過量的D-乳酸或DL-乳酸會(huì)致使血液中含較多D-乳酸，造成體 液中酸度過高，繼而出現(xiàn)機(jī)體疲勞，代謝紊亂，甚至引起酸中毒等癥狀［12-13］；世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定人體每天攝取控制在100 mg/kg以下［14］。我國(guó)市場(chǎng)生產(chǎn)的乳酸主要是用發(fā)酵法［15-16］或化學(xué)合成法，大多是DL-乳酸制品。由此建立對(duì)乳酸鋅及其制品準(zhǔn)確測(cè)定L-乳酸鋅的方法，對(duì)于控制品質(zhì)、提高食品安全及監(jiān)督水平具有重要的意義。

大多研究利用手性添加劑或衍生化反應(yīng)對(duì)手性化合物進(jìn)行拆分［17-20］，實(shí)驗(yàn)過程較為繁瑣；因此近年已有許多研究利用手性固定相將對(duì)映體進(jìn)行直接拆分［21-22］。Sumichiral OA-5000手性色譜柱是在反相模式中通過配位交換相互作用進(jìn)行手性識(shí)別，其手性配位體是青霉胺涂敷在ODS硅膠表面，因此限制了添加到流動(dòng)相的有機(jī)溶劑用量，而且流動(dòng)相中必須包含Cu2+離子。從手性識(shí)別機(jī)理分析，氨基酸、羥基酸等待分離物與手性固定相、中心金屬離子三者形成配位絡(luò)合物（非對(duì)映體復(fù)合物），由于非對(duì)映體絡(luò)合物相對(duì)穩(wěn)定性不同而致使表現(xiàn)對(duì)映體分離的選擇性［23］；因此該柱能有效地分離羥基酸的對(duì)映異構(gòu)體，在應(yīng)用于D-乳酸、L-乳酸異構(gòu)體及其衍生物的分離中極為廣泛。

目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道直接分離測(cè)定D-乳酸鋅、L-乳酸鋅的方法。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，利用OA-5000手性色譜柱來(lái)分離D-乳酸鋅和L-乳酸鋅，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定L-乳酸鋅的光學(xué)純度，希望建立一種快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠測(cè)定L-乳酸鋅光學(xué)純度的方法。

1　材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸鋅樣品 高郵市申夏生物技術(shù)有限公司、南通飛宇生物科技有限公司、南通勵(lì)成生物工程有限公司、上海申夏生物工程有限公司、鄭州瑞普生物工程有限公司、江西武藏野生物化工有限公司；L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；五水硫酸銅（純度≥99.5%） 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

自動(dòng)進(jìn)樣1100 HPLC儀 美國(guó)Agilent公司；SUMICHIRAL OA-5000手性色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 日本住友化學(xué)株式會(huì)社；AL104電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1 色譜條件

SUMICHIRAL OA-5000手性色譜柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.6～1 mmol/L CuSO4·5H2O［20-21］；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速0.7～1.0 mL/min；柱溫20～40 ℃；進(jìn)樣量5 μL［24-25］。

1.3.2 定量與分離

精密稱取樣品0.250 g，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻。將配制好的溶液進(jìn)行HPLC色譜分離，進(jìn)樣量為5 μL。

L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w，按下式計(jì)算：

式中：AL為L(zhǎng)-乳酸鋅的色譜峰面積；AD為D-乳酸鋅的色譜峰面積。

1.3.3L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取0.375 g L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容得到3.75 mg/mL儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液0.4、2、4、6、8、10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，配制成0.15、0.75、1.50、2.25、3.00、3.75 mg/mL，經(jīng)過濾膜（0.22 μm）后進(jìn)樣。以L-乳酸鋅峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 定量限與檢測(cè)限

取質(zhì)量濃度0.316 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用流動(dòng)相成比例稀釋后進(jìn)樣。以RSN≥10時(shí)，測(cè)得此色譜條件下的定量限；RSN≥3時(shí)測(cè)得檢測(cè)線。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取線性關(guān)系條件下2.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，以L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取線性關(guān)系條件下2.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液和乳酸鋅樣品溶液，放置0、4、8、12、24、48 h和72 h后進(jìn)樣測(cè)定，以L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量計(jì)算RSD。

1.3.7回收率實(shí)驗(yàn)

配制乳酸鋅樣品溶液，分別加入高、中、低劑量的L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品加入量：1）低劑量為0.113 g（樣品取樣量的75%）；2）中劑量為0.150 g（樣品取樣量的100%）；3）高劑量為0.188 g（樣品取樣量的125%），每個(gè)梯度測(cè)定3 次，計(jì)算回收率。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化結(jié)果

初始色譜條件選用流動(dòng)相CuSO4·5H2O濃度為0.60～1.0 mmol/L，流速為0.70～1.0 mL/min，柱溫為20～40 ℃進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過紫外全波長(zhǎng)掃描得到乳酸鋅在波長(zhǎng)254 nm處有最大吸收，且由于CuSO4·5H2O在低溫條件下易發(fā)生結(jié)晶，優(yōu)化后最終選用色譜條件為流動(dòng)相為1 mmol/L CuSO4·5H2O，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，測(cè)定效果最好。

2.2L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，L-乳酸鋅峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=218.52X+19.054，R2為0.999 9，線性范圍：0.147～3.675 mg/mL，在此范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

圖1　1L-乳酸鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1　Standard curve of L-zinc lactate

2.3專屬性實(shí)驗(yàn)

取光學(xué)純度大于96%的L-乳酸鋅溶液進(jìn)樣并記錄色譜圖，確定分離度。D-乳酸鋅、L-乳酸鋅峰分離度為5.27（不小于1.5）；L-乳酸鋅峰的理論塔板數(shù)為5 003（不小于5 000）。L-乳酸鋅保留時(shí)間為20.846 min，D-乳酸鋅保留時(shí)間為27.426 min。表明D-乳酸鋅和L-乳酸鋅分離效果良好（圖2）。

圖2　2D--乳酸鋅、L-乳酸鋅專屬性高效液相圖譜Fig.2　Typical HPLC chromatograms of D-zinc lactate and L-zinc lactate

2.4定量限與檢測(cè)限

測(cè)定按比例稀釋后溶液的信噪比。當(dāng)RSN≥10時(shí)，測(cè)得L-乳酸鋅定量限質(zhì)量濃度為3.10×10－2mg/mL；當(dāng)RSN≥3時(shí)，測(cè)得L-乳酸鋅檢測(cè)限質(zhì)量濃度為1.23× 10－2mg/mL。

2.5精密度

按照1.3.5節(jié)配制3 組精密度測(cè)試溶液，每組進(jìn)樣6 次，以L-乳酸鋅含量計(jì)算，得到RSD為0.044%（遠(yuǎn)小于5%），表明方法的精密度較高（表1）。

表1　1L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量測(cè)定的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1　Precision of experimental data for the proportion of zinc L-lactate relative to total zinc lactate

2.6穩(wěn)定性

按照1.3.6節(jié)配制3 組穩(wěn)定性測(cè)試溶液，放置0、4、8、12、24、48 h和72 h后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液L-乳酸鋅峰面積RSD為0.061%（遠(yuǎn)小于5%），樣品溶液L-乳酸鋅峰面積RSD為0.074%；結(jié)果表明該方法測(cè)定L-乳酸鋅有較好的穩(wěn)定性（表2）。

表2　2L-乳酸鋅測(cè)定的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2　Results of stability tests

2.7回收率

按照1.3.7節(jié)配制回收率測(cè)試溶液，分別加入樣品量75%、100%和125%的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)加入量進(jìn)行3 組平行，計(jì)算得L-乳酸鋅平均回收率為99.8%（在規(guī)定80%～120%之間），表明該法具有較高回收率（表3）。

表3　3L-乳酸鋅回收率實(shí)驗(yàn)Table3　Results of spiked recovery tests

2.8樣品L-乳酸鋅含量測(cè)定

采用該色譜條件測(cè)定各樣品L-乳酸鋅含量。高郵市申夏生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的L-乳酸鋅含量為（99.55±0.071）%，南通飛宇生物科技有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.49±0.014）%，南通勵(lì)成生物工程有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.43±0.007）%，上海申夏生物工程有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.48±0.049）%，鄭州瑞普生物工程有限公司的L-乳酸鋅含量為（99.51±0.014）%，江西武藏野生物化工有限公司的L-乳酸鋅含量為（49.11±0.17）%。

3　結(jié) 論

該色譜條件下測(cè)定L-乳酸鋅和D-乳酸鋅的分離度達(dá)5.27且L-乳酸鋅有良好的專屬性；L-乳酸鋅檢測(cè)限質(zhì)量濃度為1.23×10－2mg/mL，定量限質(zhì)量濃度為3.10×10－2mg/mL。在線性范圍0.147～3.675 mg/mL內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；重復(fù)測(cè)試計(jì)算L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量RSD為0.044%。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試溶液在放置72 h內(nèi)測(cè)定，L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量RSD僅為0.061%，而樣品溶液中L-乳酸鋅占總?cè)樗徜\含量RSD為0.074%。平均回收率達(dá)到99.8%。結(jié)果表明該色譜法測(cè)定乳酸鋅中L-乳酸鋅含量檢測(cè)限與定量限低，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，回收率高，可用于L-乳酸鋅的準(zhǔn)確測(cè)定和品質(zhì)監(jiān)控。

［1］ 王榮蛟， 信愛國(guó)， 張春勇， 等. 乳酸鋅對(duì)仔豬小腸形態(tài)學(xué)、小腸黏膜金屬硫蛋白1和組織急性期蛋白mRNA表達(dá)的影響［J］. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2014， 26（4）： 1068-1076.

［2］ PHILCOX J C， STURKENBOOM M， COYL E， et al. Metallothionein in mice reduces intestinal zinc loss during acute endotoxin inflammation， but not during starvation or dietary zinc restriction［J］. Journal of Nutrition， 2000， 130（8）： 1901-1909.

［3］ 煙海麗. 乳酸鋅對(duì)比葡萄糖酸鋅治療兒童急性腹瀉病的臨床研究［J］.兒科藥學(xué)雜志， 2014， 20（5）： 18-20.

［4］ 李峰， 許麗華， 欒善東， 等. L-乳酸鋅的制備研究［J］. 河南化工，2003（12）： 17-19.

［5］ RAM K， PRAGYA S. EPR and optical absorption studies on VO2+ions in zinc lactate trihydrate［J］. Journal of Magnetism and Magnetic Materials， 2006， 307（2）： 308-312.

［6］ KATRIN P， MICHAEL R， KATRIN S， et al. Lactic acid delays the inflammatory response of human monocytes［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015， 457（3）： 412-418.

［7］ 鄺聲耀， 唐凌， 張純， 等. 有機(jī)鋅在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的研究與應(yīng)用［J］. 四川畜牧獸醫(yī)， 2006， 33（7）： 18-20.

［8］ OLUTOSIN O O， DION R B， GERMAIN N， et al. High-performance liquid chromatographic assay of （±）-lactic acid and its enantiomers in calf serum［J］. Journal of Chromatography B， 1999， 727（1/2）： 23-29.

［9］ 張樹銀. L-乳酸鋅的合成工藝研究： 上冊(cè)［M］. 鄭州： 河南科技，2012： 65.

［10］ JOHN R P， NAMPOOTHIRI K M， PANDEY A. Fermentative production of lactic acid from biomass： an overview on process developments and future perspectives［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 74（3）： 524-534.

［11］ GIORGIO C， ANNA MARIA P， CARLO S， et al. A simple， sensitive and effi cient assay for the determination of D- and L-lactic acid enantiomers in human plasma by high-performance liquid chromatography［J］. Journal of Chromatography A， 2011， 1218（6）： 787-792.

［12］ 鄒水洋， 郭祀遠(yuǎn)， 肖凱軍. 生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乳酸的研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2008， 24（4）： 394-400.

［13］ 王立梅， 齊斌. L-乳酸應(yīng)用及生產(chǎn)技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)， 2007，28（10）： 608-612.

［14］ WEE Y J， KIM J N， RYU H W. Biotechnological production of lactic acid and its recent applications［J］. Food Technology and Biotechnology， 2006， 44（2）： 163-172.

［15］ 蔡聰?shù)兀?姜婷， 鄭兆娟， 等. 等離子體誘變凝結(jié)芽孢桿菌提高木糖利用能力高產(chǎn)三-乳酸［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（1）： 125-129. doi：10.7506/spkx1002-6630-201401024.

［16］ PRATHAMESH S， KAL E. Isolation and identification of bacteria from curd and its application in probiotic chocolate［J］. European Journal of Experimental Biology， 2014， 4（6）： 95-97.

［17］ C UONG M N， GYUNG J C， YONG H C， et al. D- and L-lactic acid production from fresh sweet potato through simultaneous saccharifi cation and fermentation［J］. Biochemical Engineering Journal，2013， 81： 40-46.

［18］ 楊丹， 徐旭， 陳宇靜， 等. 柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定乳酸的光學(xué)純度［J］. 分析試驗(yàn)室， 2008， 27（4）： 52-55.

［19］ 黃露， 余麗雙， 陳毅挺. 1-乙基-3-甲基咪唑L-乳酸鹽作為手性配體用于氨基酸的手性拆分［J］. 色譜， 2014， 32（11）： 1225-1229.

［20］ 曾蘇， 章立， 劉志強(qiáng). RP-HPLC手性流動(dòng)相添加劑法分析尿中氧氟沙星對(duì)映體［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 1994， 29（3）： 223-227.

［21］ 蘇紅清， 楊若因， 李學(xué)英， 等. 手性色譜柱法測(cè)定L-苯丙氨酸的光學(xué)純度［J］. 食品與藥品， 2012， 14（9）： 349-351.

［22］ 馮立科， 楊愛君. 高效液相色譜法直接拆分和測(cè)定酸奶中的乳酸手性對(duì)映體［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工： 學(xué)刊， 2014（12）： 43-49.

［23］ 汪全義， 張義文， 楊丹， 等. HPLC手性固定相法測(cè)定乳酸光學(xué)純度［J］.中國(guó)藥學(xué)， 2009， 31（20）： 2456-2458.

［24］ 衛(wèi)生部. GB 25555—2010 食品添加劑 L-乳酸鈣［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

［25］ 劉冬梅， 吳暉， 余以剛， 等. 高效液相色譜法對(duì)泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分離和測(cè)定［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2007， 23（8）： 74-77.

Methodology Validation for Determination of L-Zinc Lactate by High Performance Liquid Chromatography with A Chiral Column

HE Yueming1， WANG Shan2， JIE Qinfeng2， QIU Weihua2， HUANG Xiaowan1， DENG Zeyuan1，*
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang Universit y， Nanchang 330047， China；2. Center for Disease Control and Prevention of Jiangxi Province， Nanchang 330029， China）

This paper describes the development of a validated method for determining L-zinc lactate by high performance liquid chromatography （HPLC）. An ideal chromatographic separation between D-zinc lactate and L-zinc lactate was achieved on an OA-5000 chiral column using 1 mmol/L CuSO4·5H2O as mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The established calibration curve showed a good linearity over the concentration range of 0.147 to 3.675 mg/mL， with a correlation coefficient of 0.999 9 （n = 6）. The relative standard deviation （RSD） for precision and stability were respectively 0.044% was and 0.061%， and the average recovery was （99.8 ± 1.90）% with RSD of 1.90%. It is shown that this method is simple，accurate and reliable， and can be used to monitor the content of L-zinc lactate.

high performance liquid chromatography （HPLC）； L-zinc lactate； chirality

TS202.3

A

1002-6630（2015）14-0107-04

10.7506/spkx1002-6630-201514021

2014-11-16

2013年食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目（spaq-2013-25）

何悅銘（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：he_yue_ming1992@163.com

鄧澤元（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與功能食品。E-mail：dengzy@ncu.edu.cn