何　翊，秦　燕，范亞葦，鄧澤元，胡蔣寧

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

槲皮素及其乙酸乙酯衍生物的平衡溶解度和油水分配系數的測定

何翊，秦燕，范亞葦，鄧澤元，胡蔣寧*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

通過測定槲皮素及其酯化物的平衡溶解度和油水分配系數，檢測酯化后的槲皮素衍生物脂溶性是否提高。采用高效液相色譜法測定槲皮素及3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素在水、不同緩沖鹽溶液中的質量濃度；采用搖瓶-液相色譜法，測定二者在正辛醇-水、緩沖液體系中的油水分配系數。37 ℃時，槲皮素在水中的平衡溶解度為23.02 μg/mL，而3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素在水中的平衡溶解度更小，為10.23 μg/mL。隨著溶劑pH值的增大，槲皮素的平衡溶解度增大，3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素變化并不顯著。槲皮素、3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素在正辛醇-水體系條件下的油水分配系數分別為1.819、3.696。酯化修飾后的3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素脂溶性高于槲皮素。

槲皮素；3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素；平衡溶解度；油水分配系數

槲皮素，3，3'，4'，5，7-五羥基黃酮，是膳食中最常見的類黃酮之一，廣泛存在于水果和蔬菜中，如洋蔥、茶葉、蘋果和莓類等植物性食品中，同時也是一些中草藥如槐米花、三七、銀杏葉等的有效成分，在機體內能發(fā)揮有益的健康保護作用。這種保護作用包括抗氧化［1］、抗炎癥［2-3］、血管舒張［4-6］、抗腫瘤［7-8］等。但由于槲皮素的分子結構中含有多個極性羥基基團，親脂性較弱，并且由于其分子結構中的羥基結構造成的分子間作用，形成氫鍵，造成晶格能較高，其水溶性也較弱，在水中的溶解度只有7μg/mL［9］。槲皮素進入體內后，吸收并代謝，以甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化的簡單代謝為主，存在強烈的首過效應，生物利用度低，一直以來在臨床上作為藥物而使用有很大的局限性［10］。本實驗室通過酯化修飾合成了3，7，3'，4'-O-四乙酸乙酯槲皮素（3，7，3'，4'-O-tetraethyl acetate quercetin，Eaq4）［11］，如圖1所示，以期提高槲皮素的脂溶性以及在體內的穩(wěn)定性，從而提高其生物利用度［12］。

本實驗通過對槲皮素及其乙酸乙酯衍生物Eaq4的平衡溶解度、表觀油水分配系數進行研究和測定，初步考察槲皮素及其酯化衍生物的溶解性和滲透性，以期為槲皮素及其衍生物的體內吸收代謝及其他相關藥學研究提供參考。

圖1　Eaq4的化學結構Fig.1　Chemical structure of 3，7，3'，4'-O-tetraethyl acetate quercetin

1　材料與方法

1.1材料與試劑

槲皮素 上海晶純生化科技股份有限公司；Eaq4，本實驗室通過以槲皮素為原料的烷基化合成，利用柱層析、制備色譜技術純化，高效液相色譜純度為95.5%；甲醇（色譜純） 德國Meker公司；其他有機試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

FA1604電子天平 上海精密科學儀器有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；5810R離心機 德國艾本德公司；ZD-88 PK恒溫搖床 蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-水（73∶27，V/V）；流速1 mL/min；檢測波長365 nm；柱溫30 ℃。

1.3.2標準曲線的繪制

精密稱取槲皮素，Eaq4對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋，配成質量濃度1 mg/mL儲備液，采用逐級稀釋法配成0.5、0.05、0.025、0.01 mg/mL標準溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄峰面積。

1.3.3精密度的測定［13］

取槲皮素和Eaq4對照品0.5、0.25、0.1 mg/mL 3 個質量濃度，按1.3.1節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6 次，以峰面積來考察其日內精密度。同樣，取槲皮素和Eaq4對照品0.5、0.25、0.1 mg/mL 3 個質量濃度，每日進樣測定1 次，記錄峰面積，連續(xù)測試6 d，考察日間精密度。

1.3.4回收率的測定

分別稱取含量已知的槲皮素和Eaq4對照品5 mg，分別置于10 mL量瓶中，再分別加入0.6、0.5、0.5 mg/mL對照品溶液適量，甲醇定容至刻度，進樣測定，計算平均回收率。

1.3.5不同pH值緩沖溶液條件下平衡溶解度的考察［14］

按藥典方法配制pH值為7.4的磷酸緩沖液，分別以NaOH溶液和磷酸溶液調節(jié)一系列pH值分別為2.5、4.5、5.8、6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸緩沖液。取過量的槲皮素及Eaq4，分別加入1 mL純水、0.1 mol/L鹽酸，pH值為2.5、4.5、5.8、6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸緩沖液于2 mL試管中。37 ℃條件下放入恒溫搖床中避光振蕩24 h，靜置，離心（13 000 r/min、5 min），各吸取上清飽和液，經適當稀釋后，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以標準曲線法計算槲皮素及Eaq4在不同pH值溶液中的溶解度。

1.3.6油水分配系數的測定［15］

采用經典的搖瓶法，以正辛醇-水為系統(tǒng)測定槲皮素及Eaq4的油水分配系數。取適量槲皮素及Eaq4溶解于被水飽和的正辛醇中，制成藥物的正辛醇溶液，精密量取該溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，再分別加入被正辛醇飽和的水、pH 5.8、6.5，7.4的磷酸緩沖液4.5 mL，放入恒溫搖床中，于37 ℃避光振搖24 h平衡，離心，取上層正辛醇溶液400 μL，冷凍干燥12 h，加入1 mL甲醇溶液，10 μL注入高效液相色譜儀檢測；取1.0 mg/mL對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以外標法以峰面積計算槲皮素和Eaq4的質量濃度，按公式（1）、（2）計算水相質量濃度和油水分配系數。

式中：ρ初為初始藥物質量濃度/（mg/mL）；ρo為油相藥物質量濃度/（mg/mL）；ρw為水相質量濃度/（mg/mL）；P為油水分配系數。

2　結果與分析

2.1標準曲線

取槲皮素和Eaq4儲備液稀釋至0.5、0.05、0.025、0.01 mg/mL，按1.3.1節(jié)色譜條件進行液相色譜測定，槲皮素的保留時間為3.308 min，Eaq4保留時間為15.472 min，記錄峰面積。以槲皮素和Eaq4的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立標準曲線，得其線性回歸方程：Y=10.8x－2.323 9（R2=0.999 8）；Y=2.598 8x+4.402 6（R2=0.995）。結果表明，槲皮素和Eaq4在0.01～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好。

圖2　槲皮素及Eaq4的HPLLCC圖Fig.2　HPLC chromatograms of quercetin and Eaq4

2.2精密度的測定

如表1所示，日間、日內精密度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于2%，表明檢測方法可靠，穩(wěn)定性好。

2.3回收率的測定

表2　槲皮素及其酯化物的回收率Table2　Recoveries of quercetin and its ethyl acetate derivative

回收率結果如表2所示。平均回收率為99.19%、99.94%。結果表明：該法回收率高，可用于槲皮素和Eaq4的平衡溶解度及油水分配系數的測定。

2.4不同溶劑條件下的平衡溶解度

如表3所示，槲皮素的溶解度隨著溶劑pH值的增加而逐漸增大，在1 mol/L鹽酸溶液中的溶解度大于在pH值為2.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中的溶解度，而Eaq4隨溶劑pH值的增加，沒有明顯變化。

表3　槲皮素及其酯化物在不同介質中的平衡溶解度（37 ℃）Table3　Equilibrium solubility of quercetin and its ethyl acetate derivative in different media （37 ℃）

2.5油水分配系數

表4　槲皮素及其酯化物在不同溶液體系中的表觀油水分配系數（37 ℃）37Table4　Apparent oil-water partition coefficients of quercetin and its ethyl acetate derivative in different solution systems （37 ℃）

如表4所示，槲皮素的表觀油水分配系數小于Eaq4，表明其脂溶性小于Eaq4。槲皮素在pH值偏堿性時，lgP小于0，親水性更強，而Eaq4在不同pH值條件下的lgP值變化不大，故pH值對槲皮素的影響較顯著，對Eaq4的影響不大。

3　討 論

在37 ℃條件下不同pH值溶液中藥物溶解度的變化是由其化學結構所決定的。通常藥物以分子型通過生物膜，進入細胞后，在膜內水介質中解離成離子型，以離子型起作用。槲皮素是一個弱酸性藥物，其pKa約為6.5，當溶液的pH值大于藥物的pKa時，藥物解離度高，藥物在溶液中大部分以離子形式存在，即藥物的溶解度大；當溶液的pH值小于藥物的pKa時，藥物的解離受到抑制，藥物在溶液中主要以分子形式存在，即溶解度小［16］。從槲皮素溶解度的測定結果表明，槲皮素的溶解度受介質的pH值影響較大，隨著pH值增大，槲皮素的溶解度也增大；當pH值大于6.8時，槲皮素的溶解度增加明顯，在pH值為8時，達到101.84 μg/mL，測得與鐘玲等［14］測定蘆丁在不同pH值條件下溶解度的變化規(guī)律相似，這與槲皮素分子中的酸性羥基堿化成鹽有關。而Eaq4的溶解度受pH值的影響并不顯著，說明其在實驗pH值范圍內主要以分子形式存在。而人體腸道吸收主要段的pH值在6～8，主要吸收親脂性藥物［17］，槲皮素易解離，難被吸收，分子型的藥物更易吸收，所以Eaq4在腸道內可能比槲皮素有更好地吸收。該實驗結果為研究2種藥物在體內吸收過程中的轉運方式提供了參考依據。

藥物在體內的溶解、吸收、分布、轉運與藥物的水溶性和脂溶性有關，亦即和油水分配系數有關。藥物要有適當的脂溶性，才能擴散并透過生物膜，而具有水溶性才有利于藥物在體液內轉運，達到作用部位與受體結合，從而產生藥物效應，所以藥物需要有適當的油水分配系數［18-19］。

本實驗采用經典的搖瓶法測定樣品的油水分配系數，以正辛醇-水為系統(tǒng)，液相法進行測定，操作簡便，準確性好［20-21］。以正辛醇-水系統(tǒng)測出的油水分配系數對預測藥物的定量結構-吸收等有重要意義。一般將藥物分為3類：lgP小于－0.3的水溶性藥物為第1類，lgP在0.3～4.5的為第2類，lgP大于4.5的脂溶性藥物為第3類［22-23］。槲皮素lgP為－0.803，Eaq4 的lgP為3.696，可以推斷Eaq4的脂溶性較槲皮素更好，可能有較高的吸收率及組織分布。Eaq4是槲皮素與溴乙酸乙酯發(fā)生烷基化反應生成的具有酯類基團的醚類化合物，醚類化合物由于醚中的氧原子有孤對電子，能吸引質子［24］，具有親水性，碳原子具有親油性，使醚類化合物在脂-水交界處定向排布，易于通過生物膜；乙酸乙酯基提高了化合物的脂溶性，進入細胞內后，又易于在體內酶的作用下發(fā)生水解反應生成羧酸，從而提高其水溶性，提高其生物利用度。以上只是通過分析槲皮素及其酯化物的理化性質來推測其在體內的吸收代謝，更進一步的研究其在體內的吸收轉運機制，則需要在Caco-2細胞模型條件下加以驗證［25］。

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Determination of Equilibrium Solubility and Apparent Oil/Water Partition Coefficients of Quercetin and Its Ethyl Acetate Derivatives

HE Yi， QIN Yan， FAN Yawei， DENG Zeyuan， HU Jiangning*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China）

This study aimed to determine the equilibrium solubility and oil/water partition coefficients of quercetin and its ester derivative. The equilibrium solutions of quercetin and its ethyl acetate derivative in various media were detected by high performance liquid chromatogram （HPLC）； and the shake flask-HPLC method was applied to determine the partition coefficients of quercetin and its ethyl acetate derivative in n-octanol-water-buffer solutions of different pH values. The equilibrium solubility of querctin and its ethyl acetate derivative was 23.02 and 10.23 μg/mL in water at 37 ℃， and the equilibrium solubility of querctin increased with increasing pH of the buffer solution， but no remarkable change was observed for its ethyl acetate derivative. The partition coefficients of quercetin and its ethyl acetate derivative in n-octanolwater-buffer solutions of different pH were 1.819 and 3.696， respectively. The esterification modification of quercetin improved its lipid solubility.

querctin； ethyl acetate derivative of quercetin； equilibrium solubility； apparent oil/water partition coefficient

TS201.2

A

1002-6630（2015）14-0055-04

10.7506/spkx1002-6630-201514011

2014-11-05

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31360370）；2014年江西省科學技術研究項目（GJJ14092）

何翊（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然活性物質開發(fā)與利用。E-mail：heyi615@hotmail.com

胡蔣寧（1981—），男，副教授，博士，研究方向為天然活性物質開發(fā)與利用。E-mail：hujiangning@ncu.edu.cn