張喜峰，羅光宏，張芬琴，崔　瑋

（1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.河西學院 凱源生物技術開發(fā)中心 甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅 張掖 734000）

響應面試驗優(yōu)化［Bmim］Cl-Na2SO4雙水相萃取分離琉璃苣種子總黃酮工藝

張喜峰1，羅光宏2，*，張芬琴1，崔瑋1

（1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.河西學院 凱源生物技術開發(fā)中心 甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅 張掖 734000）

利用1-丁基-3-甲基咪唑氯（［Bmim］Cl）和硫酸鈉（Na2SO4）雙水相體系萃取分離琉璃苣種子總黃酮，首先對［Bmim］Cl、Na2SO4、總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)進行單因素試驗，確定雙水相體系組成為21% ［Bmim］Cl-25% Na2SO4。然后利用Box-Behnken試驗，對總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)進行了優(yōu)化，結果表明：粗提物質(zhì)量分數(shù)11.9%、pH 5.1、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)1.6%條件下琉璃苣種子總黃酮萃取率可達96.91%，與預測值97.19%接近。說明本優(yōu)化工藝具有可行性。

琉璃苣；離子液體；雙水相

琉璃苣（Borago officinalis L.），又稱玻璃苣、黃花草，濱來香菜，為紫草科琉璃苣屬一年生草本植物，原產(chǎn)小亞細亞、地中海沿岸［1］。琉璃苣是一種既能觀賞又能食用的植物，它的嫩莖葉具有黃瓜的清香，可以作為鮮菜煮食，也可用于芳香調(diào)味料。琉璃苣種子含有豐富蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、黃酮類化合物［2-3］?？傸S酮是一種很強的抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，阻止細胞的退化、衰老［4-5］。

近年來，由于雙水相萃取技術具有高效、溫和、操作簡便、容易放大和能有效保持生物活性等優(yōu)點，被廣泛應用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域［6-12］。但傳統(tǒng)的雙水相體系有原料成本較高、高聚物回收利用困難等缺點。隨著對雙水相技術研究的不斷深入，出現(xiàn)了離子液體-鹽雙水相體系，離子液體是繼超臨界CO2后的一種極具吸水力的綠色溶劑，被稱為環(huán)境友好、可設計性溶劑。與傳統(tǒng)的有機溶劑萃取法比較，離子液體雙水相具有無毒、安全、簡便、快捷等優(yōu)點；與高聚物雙水相比較，溶液酸度范圍較寬、不易乳化，界面更清晰，離子液體經(jīng)簡單處理后可再利用［13-15］。

以琉璃苣種子為材料，采用親水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯（［Bmim］Cl）和硫酸鈉（Na2SO4）為雙水相體系萃取琉璃苣種子總黃酮，通過單因素試驗和Box-Behnken設計對琉璃苣總黃酮萃取條件進行優(yōu)化，以期為琉璃苣進一步開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

琉璃苣種子由甘肅凱源生物技術開發(fā)中心提供，烘干后用小型粉碎機粉碎至約40 目備用。

蘆丁標準品（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；［Bmim］Cl（純度＞99%） 中國科學院蘭州化學物理研究所；Na2SO4、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2儀器與設備

PL-203電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；XO-SM5O超聲波-微波反應系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋 揚州市三發(fā)電子有限公司；722型分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1琉璃苣總黃酮粗提物的制備

稱取50 g琉璃苣種子粉末，加入50%的乙醇溶液500 mL，功率350 W，超聲處理5 min后，4 000 r/min離心5 min，70 ℃減壓濃縮，真空干燥，得到琉璃苣總黃酮粗提物。

1.3.2雙水相萃取

確定體系總質(zhì)量為10 g，加入適量的［Bmim］Cl、Na2SO4、琉璃苣總黃酮粗提物，蒸餾水補至10 g，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，靜置10 min，當兩相達到相平衡時，琉璃苣總黃酮富集于含離子液體［Bmim］Cl的上相中，讀取上下相的體積，測定上下相總黃酮含量，計算琉璃苣總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y。計算如式（1）～（3）所示：

1.3.3蘆丁標準曲線繪制［16］

稱取干燥至恒質(zhì)量蘆丁標準品10 mg，用體積分數(shù)50%乙醇溶液配制成總黃酮質(zhì)量濃度為1 mg/mL的乙醇溶液。分別精確吸0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于6個10 mL于棕色容量瓶中，加入0.3 mL質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入0.3 mL質(zhì)量分數(shù)為10%硝酸鋁，搖勻，靜置6 min，再加入4 mL質(zhì)量分數(shù)為4% NaOH溶液，用水定容至刻度，靜置15 min，以試劑空白作參照，在波長510 nm處測吸光度（A），以吸光度為橫坐標，蘆丁含量為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=1.233x－0.003 4，R2=0.991 2。其中x為溶液中蘆丁的質(zhì)量（mg），A為吸光度。

1.3.4琉璃苣總黃酮萃取工藝優(yōu)化

1.3.4.1單因素試驗

分別以［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)（19%、21%、23%、25%、27%）、Na2SO4質(zhì)量分數(shù)（21%、23%、25%、27%、29%）、總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)（8%、10%、12%、14%、16%）、pH值（3、4、5、6、7）及無水乙醇質(zhì)量分數(shù)（0%、1%、2%、3%、4%）為單因素，考察各因素對萃取率及分配系數(shù)的影響。

1.3.4.2Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定響應面試驗的因素水平。研究總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)三因素三水平17 個組合Box-Behnken試驗，確定琉璃苣總黃酮萃取的最佳工藝條件，試驗因素及水平見表1。

表1　Box-Behnken設計因素與水平表Table1　Factors and their coded levels used in Box-Behnken design

1.4數(shù)據(jù)分析

單因素試驗和Design-Expert 7.0軟件在試驗設計的同時按相應方法進行，所有實驗均重復3 次，取平均值。

2　結果與分析

2.1［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)對琉璃苣總黃酮萃取的影響

在［Bmim］Cl-Na2SO4雙水相體系中，選擇質(zhì)量分數(shù)為19%、21%、23%、25%、27%的［Bmim］Cl，Na2SO4質(zhì)量分數(shù)為29%，質(zhì)量分數(shù)為10%總黃酮粗提物組成雙水相，室溫（25℃）條件下，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖1。

圖1?。跙mim］Cl質(zhì)量分數(shù)對總黃酮萃取的影響Fig.1　Effect of ［Bmim］Cl concentration on the partitioning coefficient and extraction yield of flavonoids

由圖1可知，隨著［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)的增加，琉璃苣總黃酮萃取率和分配系數(shù)先增大后減小，當［Bmim］Cl質(zhì)量分數(shù)為21%時，總黃酮萃取率和分配系數(shù)達到最大值。主要原因是［Bmim］Cl與黃酮類化合物之間形成π-π相互作用，并且水與離子液體、總黃酮可形成氫鍵網(wǎng)絡，這樣在親水極性區(qū)形成的網(wǎng)絡結構可以增加總黃酮的親水性，使其在極性區(qū)穩(wěn)定地存在，從而促進總黃酮在兩相間的轉移［17-18］。當離子液體質(zhì)量分數(shù)過大時，體積排阻效應增大導致總黃酮在相間的傳遞和在相中的擴散阻力大大增加，不利于總黃酮進入離子液體相，萃取率明顯降低［19-20］。因此，確定離子液體［Bmim］Cl最佳質(zhì)量分數(shù)為21%。

2.2Na2SO4質(zhì)量分數(shù)對琉璃苣總黃酮萃取的影響

分別選擇Na2SO4質(zhì)量分數(shù)21%、23%、25%、27%、29%，質(zhì)量分數(shù)21% ［Bmim］Cl和10%總黃酮粗提物組成雙水相體系，在室溫條件下，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖2。

圖2　Na2Na2SOSO4質(zhì)量分數(shù)對總黃酮萃取的影響Fig.2　Effect of Na2SO4concentration on the partitioning coefficient and extraction yield of flavonoids

由圖2可知，當Na2SO4質(zhì)量分數(shù)低于25%時，隨著Na2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加，琉璃苣總黃酮萃取率和分配系數(shù)也逐漸增加，當大于25%時，萃取率和分配系數(shù)呈下降趨勢。其主要原因是離子液體和黃酮類化合物之間氫鍵相互作用增強。當SO42－質(zhì)量分數(shù)較大時，表面張力增大，使黃酮類化合物吸附在兩相界面，導致萃取率降低［21-23］。因此，確定最佳的Na2SO4質(zhì)量分數(shù)為25%。

2.3總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)對琉璃苣總黃酮萃取的影響

圖3　總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)對總黃酮萃取的影響Fig.3　Effect of crude flavonoid concentration on the partitioning coefficient and extraction yield of flavonoids

在室溫條件下，21% ［Bmim］Cl-25% Na2SO4雙水相體系，分別加入質(zhì)量分數(shù)為8%、10%、12%、14%、16%的總黃酮粗提物，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖3。

如圖3所示，當總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)小于10%時，琉璃苣總黃酮萃取率與分配系數(shù)隨粗提物質(zhì)量分數(shù)的增加而增加；當粗提物質(zhì)量分數(shù)大于10%時，萃取率與分配系數(shù)呈明顯下降趨勢，這可能是離子液體雙水相萃取總黃酮粗提物達到飽和，過量總黃酮粗提物造成浪費；另外過量黃酮類化合物聚集在兩相界面處，影響兩相間傳質(zhì)［24-25］。因此，確定粗提物質(zhì)量分數(shù)最佳為10%。

2.4pH值對琉璃苣總黃酮萃取的影響

在21% ［Bmim］Cl-25% Na2SO4雙水相體系中，加入10%琉璃苣總黃酮粗提物，分別用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值為3、4、5、6、7，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖4。

圖4　pH值對總黃酮萃取的影響Fig.4　Effect of pH values on the partitioning coefficient and extraction yield of flavonoids

如圖4所示，隨著pH值逐漸升高，萃取率和分配系數(shù)先增加后減?。划攑H 6時，萃取率和分配系數(shù)達到最大。主要原因是：pH值變化，影響黃酮類化合物基團解離，導致［Bmim］Cl與黃酮類化合物之間相互作用發(fā)生變化。因此，確定體系pH 6。

2.5無水乙醇質(zhì)量分數(shù)對琉璃苣總黃酮萃取的影響

在21% ［Bmim］Cl-25% Na2SO4雙水相體系中，加入10%琉璃苣總黃酮粗提物，分別加入質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、3%、4%無水乙醇，調(diào)節(jié)體系pH 6，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖5。

圖5　無水乙醇質(zhì)量分數(shù)對總黃酮萃取的影響Fig.5　Effect of NaCl concentrations on the partitioning coefficient and extraction yield of flavonoids

由圖5可知，在［Bmim］Cl-Na2SO4體系中，與不加醇比較，無水乙醇的加入使得分配系數(shù)和萃取率逐漸增加。當無水乙醇質(zhì)量分數(shù)為1%時，萃取率和分配系數(shù)達到最大值。這可能是因為［Bmim］Cl的極性與1%無水乙醇最為相似，使得分配系數(shù)和萃取率最高。隨著無水乙醇不斷加入，其取代了體系中的一部分水，使相間界面張力及電位差發(fā)生了變化，從而改變了總黃酮在兩相間的分配。因此，本實驗選擇在［Bmim］Cl-Na2SO4體系中加入1%無水乙醇。

2.6響應面試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，采用Box-Behnken設計響應面試驗，在21% ［Bmim］Cl-25% Na2SO4雙水相體系中，選取總黃酮提物質(zhì)量分數(shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)3 個因素作為試驗因素，以總黃酮萃取率為響應值設計試驗，試驗設計與結果見表2。

表2　Box-Behnken設計方案與結果Table2　Box-Behnken design arrangement and results

2.6.1Box-Behnken試驗設計方差分析

以琉璃苣總黃酮萃取率Y為響應值，采用Design-Expert 7.0軟件對試驗結果進行回歸分析，具體結果見表3。經(jīng)回歸擬合后，試驗因素對響應值的影響可用以下回歸方程表示：

Y=93.728+0.038 75A－2.462 5B－0.348 75C－4.637 5AB－2.385AC－2.622 5BC－1.261 5A2－2.449B2－1.493 5C2

為了檢驗回歸方程的有效性及各因素對萃取率的影響程度，對回歸方程進行方差分析。從表3可以看出，試驗回歸模型P=0.003 5＜0.01，說明回歸模型達到極顯著水平；失擬項P=0.325 7＞0.05，失擬項不顯著，說明試驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好。通過對P值檢驗可以看出，B、AB對總黃酮萃取率的影響達到極顯著水平，AC、BC、B2對總黃酮萃取率的影響達到顯著水平。模型復相關系數(shù)R2=0.924 7，說明該方程擬合度較高。從上述數(shù)據(jù)可以看出，此模型可以很好地反映總黃酮萃取率與粗提取質(zhì)量分數(shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)之間的關系，可以用來對總黃酮萃取率進行優(yōu)化分析與預測。

表3　對擬合二次多元模型的方差分析結果Table3　Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.6.2響應面試驗優(yōu)化及驗證

圖6　各因素交互作用的響應面圖Fig.6　Response surface plots for the effects of three factors on the extraction yield of flavonoids

各因素交互作用的響應面圖如圖6所示，根據(jù)Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design-Expert 7.0軟件獲得了各個因素的最佳條件組合為總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)11.9%、pH 5.1、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)1.6%，在此萃取條件下，琉璃苣總黃酮的萃取率可達到97.19%。為了檢驗模型預測的準確性，在最佳萃取條件下進行萃取，做3 組平行實驗所得結果為96.91%，與預測值相差0.28%，由此可見，采用響應面分析法對琉璃苣總黃酮的最佳萃取條件的優(yōu)化是行之有效的。

3　結 論

本實驗利用Box-Behnken模型對離子液體雙水相萃取琉璃苣種子總黃酮的條件進行優(yōu)化，在21% ［Bmim］Cl-25% Na2SO4雙水相體系中，最優(yōu)的萃取條件為粗提物質(zhì)量分數(shù)11.9%、pH 5.1、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)1.6%，在此萃取條件下，琉璃苣總黃酮的萃取率可達到96.91%。結果表明，通過對粗提物質(zhì)量分數(shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分數(shù)的響應面優(yōu)化是成功有效的，為提高琉璃苣種子總黃酮萃取率提供了技術支持。離子液體雙水相體系萃取分離總黃酮，界面清晰，萃取過程不發(fā)生乳化現(xiàn)象；離子液體雙水相萃取分離活性成分屬于綠色萃取技術，對于該體系萃取機理以及被萃取物的回收等問題還有待于進一步深入研究。

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Aqueous Two-Phase System Based on ［Bmim］Cl-Na2SO4for Isolation of Total Flavonoids from Borage Seed

ZHANG Xifeng1， LUO Guanghong2，*， ZHANG Fenqin1， CUI Wei1
（1. College of Agriculture and Biotechnology， Hexi University， Zhangye 734000， China；2. Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province， Kaiyuan Bio-Tech Development Center， Hexi University， Zhangye 734000， China）

In this study， the potential use of ionic liquid-based aqueous two-phase system （ILATPS） for the extraction of total flavonoids from borage seed was evaluated and optimized. The effects of independent variables including ［Bmim］Cl，Na2SO4， crude flavonoids， alcohol and pH were evaluated by single factor analysis. The optimized ILATPS consisting of 21% ［Bmim］Cl and 25% Na2SO4was selected based on its higher upper phase partitioning coefficient and recovery （extraction yield）. By adding 11.9% of crude flavonoids and 1.6% of absolute alcohol to the ILATPS and adjusting the pH to 5.1， the maximum yield of flavonoids （96.91%） was observed， which was in good agreement with the predicted value of 97.19%. In conclusion， the optimized process has good reliability.

Borago offi cinalis L.； ionic liquid； aqueous two-phase system

TS201.1

A

1002-6630（2015）14-0050-05

10.7506/spkx1002-6630-201514010

2014-12-01

甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目（1047GCCG001）；甘肅省高等教育科研項目（2014A-109；2014B-086）；河西學院校長基金項目（XZ2014-29）

張喜峰（1982—），男，講師，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)。E-mail：curiouslysxsd@163.com

羅光宏（1965—），男，教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)。E-mail：luoguanghong@163.com